7和腹腔巨噬细胞,观察在不同氧浓度状态下p38 MAPK的活性和TNF-α分泌水平的改变,同时应用p38抑制剂SB203580进行干预,证实低氧在TNF-α合成中的重要地位。在内毒素血症小鼠模型应用p38抑制剂SB203580治疗,观察小鼠血清TNF-α水平和肺组织HIF-1α蛋白的表达,阐明低氧和HIF-1α在调节脓毒症TNF-α产生的作用机制及其与p38 Ipatasertib订单 MAPK通路的关系。 研究方法 1.SB203580对小鼠巨噬细胞系TNF-α产生的抑制效应与低氧和p38 MAPK活性的关系 (1)正常氧状态下SB203580抑制LPS诱导小鼠巨噬细胞TNF-α产生的剂量关系实验 RAW264.7细胞分别用25μM和10μM SB203580预处理2 h,然后加入LPS10、100及1000 ng/ml,另外一组RAW264.7细胞分别用1-20μM SB203580预处理2h,然后加入LPS 1ng/ml或者用0.2-2μM SB203580预处理2 h,然后加入LPS 0.1ng/ml,正常氧状态下细胞继续孵育18 h,收集上清液。 (2)SB203580在正常和低氧浓度环境下对TNF-α产生的抑制效应实验

RAW264.7细胞培养液加入10μM SB203580培养2 h后加入LPS 1 ng/ml,细胞分别在正常氧、低氧(0.5%O_2)和氯化钴(100μM)模拟低氧环境孵育18 h,收集上清液。 (3)SB203580在正常和低氧浓度环境下对TNF-αmRNA转录活性及mRNA稳定性的影响实验 RAW264.7细胞处理同上,加入LPS培养2 selleck化学药品液面控制 h后,用Trizol方法提取细胞RNA。 另设实验组在加入LPS

2 h后再加入2μg/ml转录抑制剂Actinomycin D,加入Actinomycin D的时间点为0时,在10、30和60 min时间点用Trizol收集细胞RNA。 (4)正常和低氧浓度环境下SB203580抑制效应的动态监测实验 RAW264.7细胞用10μM SB203580预处理2 h,在正常氧和氯化钴(100μM)模拟低氧环境下向细胞培养液中加入LPS 1ng/ml,加入LPS的时间点记为0时,在加入LPS后1、2、4、6、8h收集上清液。 (5)低氧对p38 MAPK及其底物MAPKAPK2活性影响实验 RAW264.7细胞经10μM SB203580预处理2 h后,在正常氧浓度和低氧模拟环境接受LPS 1ng/ml刺激,LPS加入的时间点记为0时,在10、30、60 min收集细胞蛋白质。 2.低氧影响SB203580抑制小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α产生作用的实验 向原代培养的小鼠腹腔巨噬细胞培养液中加入20μM或10μM SB203580,2 h后加入LPS 1ng/ml或10 ng/ml,细胞在正常氧及氯化钴(100μM)模拟低氧环境下孵育18 h,收集上清液。 以上细胞实验均设无SB203580预处理对照组和溶剂对照组。 3.动物模型实验 (1)正常氧环境下不同剂量LPS对小鼠血清TNF-α水平的影响 小鼠接受腹腔注射0.5-3.5 mg/kg

LPS 90 min后处死,留取标本。 (2)正常氧环境和低氧环境下SB203580对内毒素血症小鼠血清TNF-α水平的影响 小鼠接受静脉注射SB203580 15、25 mg/kg,2 h后腹腔注射LPS 并且 0.5 mg/kg,将小鼠置于正常氧环境下或者低氧坏境(10%O_2),注射LPS后90 min处死小鼠,留取标本。 (3)SB203580对内毒素血症小鼠血清TNF-α水平及肺HIF-1α表达的影响 小鼠经静脉注射SB203580 15 mg/kg,2h后腹腔注射LPS 0.5 mg/kg,在注射LPS后90 min和240 min处死,留取血清和肺组织标本。 以上动物实验均设溶剂对照组和生理盐水对照组,每组3只小鼠。 3.实验标本处理方法 (1)酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞培上清液和小鼠血清TNF-α水平; (2)Real-time PCR定量检测TNF-αmRNA转录水平; (3)Western blot检测p38 MAPK活性和下游底物MAPKAPK2蛋白表达; (6)RT-PCR和Real-time PCR检测小鼠肺组织HIF-1αmRNA的表达; (7)Western blot检测小鼠肺组织HIF-1α蛋白的表达; (8)免疫组织化学染色(IHC)检测小鼠HIF-1α蛋白在肺组织中的表达及分布情况。 研究结果 1.正常氧状态下RAW264.7对LPS的刺激非常敏感。0.1 ng/ml低剂量至1000ng/ml高剂量LPS均可使RAW264.7细胞产生大量的TNF-α,比未经处理的RAW264.7细胞中TNF-α基本值增加10倍以上。SB203580对LPS诱导RAW264.7细胞产生的TNF-α具有非常明显的抑制效果,可以抑制90%以上TNF-α的产生,并且呈剂量依赖方式,高于SB203580 10μM或1μM的剂量均能有效抑制LPS1 ng/ml或0.