4分化成熟的影响以及NF-κB信号通路在该激活效应中的作用。方法:1、采用MTT法检测拟康氏木霉胞外多糖(EPS)对小鼠树突状细胞系DC2.4细胞存活率的影响,以不同浓度EPS处理DC2.4细胞24 h后检测。2、用一定浓度的拟康氏木霉胞外多糖(EPS)处理静息状态下的DC2.4细胞,在不同时间点取样封片,倒置显微镜观察EPS引起细胞形态的变化。3、用流式细胞仪检测EPS处理前后DC2.4细胞表面分子CD11c、CD86、CD80、MHC-II表达情况以及细胞吞噬活性的变化。4、用酶联免疫吸附实验检测EPS处理后细胞因子IL-12p70分泌量的变化。5、采用免疫荧光染色技术观察EPS促使DC2.4细胞核转录因子NF-κB亚基p65发生核移位。6、用EPS处理DC2.4细胞后裂解细胞提取胞质蛋白用Western blotting技术检测NF-κB的抑制蛋白IκBa的降解和丝裂原活化蛋白激酶p38MAPK的磷酸化。7、用NF-κB和p38MAPK的抑制剂(BAY 什么 11-7082、SB 203580)预处理细胞后再与EPS一起孵育取上清,检测IL-12p70含量与EPS单独处理时的差异。结果:1、MTT法检测发现EPS在2.5~400μg/mL剂量范围内对DC2.4细胞无明显细胞毒性。2、对照组DC2.4细胞呈半贴壁状态,形状不规则呈星形、蝌蚪形或梭形,加入EPS处理10

h后,与对照组相比,细胞树突分支增加、增粗、近圆形,由小渐大,多边形或具有规则的多分支的长突起。3、流式细胞仪检测结果显示经EPS诱导后,细胞表面分子的表达率为CD11c35.31%、CD86 43.49%、CD80 64.21%、MHC-II 53.66%,与空白对照组(RPMI-1640组)相比均有明显升高;流式细胞仪检测DC2.4对FITC-dextran吞噬作用结果显示,EPS组为27.38%,与空白对照组(RPMI-1640组)相比吞噬作用明显下降。4、酶联免疫吸附实验结果显示,EPS组含量为151 C59 价格 pg/mL,与空白对照组(RPMI-1640组)相比能显著提高细胞因子IL-12p70分泌量。5、免疫荧光染色技术显示,对照组DC2.4细胞内p65亚基荧光多分布松散,荧光强度较弱;而经EPS处理后,DC2.4细胞内p65亚基荧光多分布集中于核,荧光强度较强,表明EPS可以促使p65亚基发生核移位,激活核转录因子NF-κB。6、Western blotting结果显示EPS可以明显促使IκBa发生降解,p38MAPK发生磷酸化,提示EPS表明可以激活DC2.4细胞中的核转录因子NF-κB和p38MAPK。7、抑制剂(BAY 11-7082、SB203580)预处理细胞后,结果显示IL-12p70含量与EPS单独作用相比时显著下降,下降幅度分别为46.34%、42.68%,表明EPS可以通过NF-κB和p38MAPK两条信号转导通路来激活DC2.4细胞。结论:1、EPS能够促进DC2.4细胞分化成熟,上调DC2.4细胞表面分子CD11c、CD86、CD80、MHC-II的表达。2、EPS抑制DC2.4细胞对FITC-dextran的吞噬。3、EPS能够促进DC2.4细胞分泌IL-12p70。4、EPS通过NF-κB和p38MAPK信号转导通路来上调DC2.4细胞的免疫活性。
目的

肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae, S.pn）是临床常见的能够引起肺炎、脑膜炎、中耳炎和败血症的革兰阳性菌。在发展中国家肺炎链球菌性败血症致死占5岁以下儿童可预防性死亡的25%，每年导致120多万婴儿死亡。肺炎链球菌的溶血素（Pneumolysin，PLY）在细菌致病和诱导宿主防御应答中发挥重要作用，但是目前对宿主防御肺炎链球菌溶血素的分子机制尚不十分清楚。 细菌入血后，血液中的免疫细胞会与细菌及产物发生直接作用或者与感染组织分泌的信号分子发生间接的相互作用，从而引发宿主免疫防御。在这一过程中，单核细胞在机体的免疫防御中发挥了重要作用。但是目前关于单核细胞与PLY相互作用机制的研究少有报道，所以本文采用人急性单核细胞白血病单核细胞株（human acute monocyticleukemia cell line，THP-1）与PLY在体外共孵育的方式来初步探讨单核细胞与PLY相互作用的机制，研究单核细胞凋亡情况及凋亡通路信号分子的变化情况，为进一步研究PLY触发宿主瞬时和早期固有免疫应答机制奠定基础。

方法 1．采用下述实验方法研究PLY对THP-1细胞生长状态的影响：MTT法测定PLY对THP-1细胞的增殖抑制情况；瑞氏染色观察PLY对THP-1细胞形态的影响；透射电子显微镜观察PLY诱导THP-1细胞亚细胞结构改变情况；流式细胞术检测细胞凋亡率；琼脂糖凝胶电泳观察凋亡细胞DNA片段化现象；同时将△A146PLY(PLY的第146位氨基酸发生缺失突变，无溶血活性)处理组作为阴性对照。 Sorafenib溶解度 2．从以下几方面初步探讨PLY诱导THP-1细胞凋亡的免疫机制：分光光度法测定Caspase3,8,9活性；免疫细胞化学方法测定凋亡相关蛋白Bax、Bcl-xl及信号分子p38MAPK蛋白表达的变化；通过Western-Blot进一步验证p38MAPK总蛋白表达水平及其磷酸化水平变化；p38MAPK抑制剂处理后通过流式细胞术测定THP-1细胞凋亡率变化情况；同时将△A146PLY处理组作为阴性对照。 结果 1．将THP-1细胞分别与0.05、0.1、0.5、1、2.5、5μg/ml PLY共同孵育24、48、72、96h后，采用MTT法测定细胞增殖抑制情况，结果表明PLY对THP-1细胞生长具有明显的增殖抑制作用，并呈剂量和时间依赖性；0.05μg/ml和0.1μg/ml PLY分别处理THP-1细胞12h后，通过瑞氏染色观察到细胞发生明显的凋亡形态学改变，透射电子显微镜观察到THP-1细胞发生凋亡，并且出现凋亡小体和核碎裂象等典型凋亡形态特征；0.05μg/ml PLY和0.1μg/ml PLY作用THP-1细胞6h后通过AnnexinV-FITC/PI双标法检测细胞凋亡率分别为13.15%和24.58%，作用12h后细胞凋亡率分别为17.09%和60.

8%,产物溶出率达95.7%,损失率低至4.3%。最后采用硅胶柱层析法纯化牛蒡子发酵粗提物,牛蒡苷元纯化产物为白色晶体,纯度可达到99%以上。ARG体外抗肿瘤机制研究:通过MTT比色法检测ARG在体外对肿瘤细胞株和正常细胞株的增殖抑制活性,结果表明ARG具有良好的广谱抗癌活性,但对正常细胞却没有明显的抑制作用。为进一步研究ARG的抗肿瘤机制,本研究选择人肝细胞癌作为研究对象,通过Annexin V-FITC/PI双染法、透射电镜观察、线粒体跨膜电位检测、和Hoechst33342/免疫荧光染色等试验方法从细胞形态学和分子生物学角度说明ARG可以诱导Hep G2和SMMC7721细胞的凋亡。而后,采用q PCR、流式细胞仪和Western blot等试验技术检测细胞凋亡信号通路及凋亡相关因子。结果发现,当ARG作用于Hep G2细胞时,首先会破坏细胞线粒体的氧化还原功能,同时使NADPH酶和细胞色素P450酶参与的代谢过程发生异常,从而导致细胞中ROS水平升高。在ROS的影响下,MAPK信号通路中JNK和p38被激活,两者共同促进了Hep

已经 G2细胞内源性凋亡途径的活化,于此同时,p38参与激活其外源性凋亡途径并上调p53的表达。最终,在两条凋亡途径共同作用下,细胞中的caspase蛋白群被激活,从而介导了Hep G2凋亡的发生。此外,ARG还可以抑制Hep G2细胞中NF-κB的核转移和PI3K/Akt信号通路的激活。上述结果表明ARG是一种“多靶点”化合物,它可以通过调节细胞中的多种信号转导来诱导细胞的凋亡。ARG体内抗肿瘤机制研究:在对裸鼠人肝癌移植瘤进行体内抑癌作用研究中发现,ARG对人肝癌移植瘤具有显著的抑制作用,20 Rapamycin细胞系 mg/kg ARG对Hep G2移植瘤抑瘤率可达44.55%。并且几乎不会对荷瘤小鼠的一般状态及肝、肺、肾等主要脏器产生不良影响。进一步研究发现,ARG在体内抑制肿瘤组织的生长是通过诱导肿瘤细胞凋亡来实现的。其主要作用机制是通过上调p-JNK、p-p38、Bax以及TNF-α的表达介导细胞凋亡的发生。ARG体内抗肿瘤研究说明ARG不仅可以抑制肿瘤的生长,同时具有低毒的作用特点,此研究结果为ARG的进一步开发奠定了试验基础。综上所述,本研究发明建立了一种简便高效的ARG提取方法,适合于实验室自行提取制备ARG,并且此方法具有成本低廉、提取纯度高、污染少等诸多优点。在此基础之上,本研究对ARG的抗肿瘤作用及其体内外作用机制进行了深入探索。研究结果表明,ARG在体内外均具有良好的抗肿瘤作用,其作用机制主要是通过诱导肿瘤细胞凋亡来抑制肿瘤细胞的增殖。与此同时,研究还发现ARG在体外几乎不会对正常组织细胞产生抑制作用,且在动物体内具有低毒的作用特点。由此可见,ARG是一种极具开发潜力的抗肿瘤化合物,本项研究为ARG的进一步开发利用奠定了试验基础。
背景与目的糖尿病视网膜病变(Diabetic

retinopathy,DR)是糖尿病的微血管并发症,也被认为是一种慢性低度炎症性疾病。在糖尿病的早期阶段,DR的特征是视网膜屏障(the blood-retinal barrier,BRB)的破坏,而组成内层视网膜屏障的主要部分是内皮细胞,并且随着糖尿病病程的延长,内皮细胞死亡数目增加。除内皮细胞死亡外,炎症介质也会通过激活细胞内信号增加血管通透性。炎症因子白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)的水平在糖尿病患者和动物模型的视网膜、玻璃体和血清中升高,还能以旁分泌和自分泌的方式诱导自身的合成,加速并扩大糖尿病视网膜中的炎症级联反应。叉头状转录因子O1(Forkhead

selleck化学 transcription factor,Fox O1)是叉头状转录因子O亚家族中重要的一员,在调控增殖凋亡、氧化应激、调节自噬和分化等方面发挥重要作用。研究发现,在1型和2型糖尿病大鼠模型的视网膜中,Fox O1的活性增加,并伴随着炎症反应和凋亡增加。因此推测DR状态下Fox O1活性增加可能与炎症有一定的联系,但Fox O1调节内皮细胞功能的具体机制尚不清楚。研究发现,在原代大鼠肝细胞和HEK293细胞中,IL-1β通过刺激IL-1受体过表达导致胞质和核内Fox O1蛋白量增加。而在巨噬细胞中,Fox O1直接结合到IL-1β启动子上,促进IL-1β的表达增加。因此推测,IL-1β在视网膜内皮细胞中可刺激Fox O1表达增加,从而促进IL-1β的表达增加。本实验以Fox O1特异性小干扰RNA(si RNA)慢病毒载体下调内皮细胞和STZ诱导的糖尿病大鼠视网膜中的Fox O1的表达及活性,观察Fox O1在IL-1β诱导的自刺激中的作用,并探讨其机制。方法原代人视网膜血管内皮细胞(HRMECs)培养于不同糖浓度(5.6、15、25、35mmol/L)24h后,实时荧光定量PCR(Real-time PCR)和Western blotting法检测Fox O1、IL-1β的表达。HRMECs培养于重组人白介素-1β(r IL-1β)的不同浓度(0、1、2.

Key challengesremain to identify appropriate subsets of patients whowill most likely benefit from these new MTAs and effectively select these based on validated biomarkers.Moreover,better knowledge of the biology of colorectal cancer and the mechanisms via which it bypasses blockade of known signalling pathways will help us design better and more rational sequencing of these treatments,so that we can maximise the survivorship

of mCRC patients.This review outlines treatment strategies for known molecular alterations with new MTAs and highlights some promising strategies.
神经内分泌肿瘤(NENs)起源于不同器官的神经内分泌细胞,可发生于身体的任何部位,最常见于胃肠道和胰腺。随着对神经内分泌肿瘤认识的深入以及内镜、核医学等诊疗技术的发展,其诊断率呈逐年上升趋势。但由于该病的分布范围广,临床表现各异,对其诊断和治疗难以形成”金标准”。本文将对该病的基础研究进展做一综述,以期对优化神经内分泌肿瘤的诊治有所裨益。NENs起源于不同器官的神经内分泌细胞,其临床表现
目的观察具有理气化痰功效的食道通结方对食管癌细胞株增殖和凋亡的影响。方法利用SD大鼠制备食道通结方含药血清,以食管癌TE-1细胞株为观察对象,用MTT法筛选合适的含药血清浓度;再用含药血清、顺铂和含药血清+顺铂分别作用于TE-1细胞株。采用MTT检测各组肿瘤细胞的生长情况,流式细胞仪检测各组细胞周期及细胞凋亡情况,Western印迹法检测各组凋亡相关蛋白(p-Akt、Akt、P53、Bcl-2、Bax、Caspase3)的表达。结果①确定20%的含药血清为最佳含药血清浓度。②含药血清组、顺铂组和含药血清+顺铂组细胞增殖抑制率均随干预时间的延长(0 Tenofovir临床实验 h,12 h,24 h,48 h)而增加,48 h时的细胞增殖抑制率最高,分别为30.9%、35.4%和50.6%,组间差异有统计学意义(P<0.01)。③与对照组比较,顺铂组和含药血清+顺铂组G1期细胞比例增高(P<0.01),含药血清组和含药血清+顺铂组G2期细胞比例降低(P<0.05);含药血清+顺铂组G1期细胞比例高于顺铂组和含药血清组,差异有统计学意义(P<0.01);与对照组各观察时点比较,顺铂组、含药血清组和含药血清+顺铂组细胞凋亡指数均明显增加(P<0.01);顺铂组、含药血清+顺铂组各观察时点细胞凋亡指数均高于含药血清组(P<0.01),含药血清+顺铂组各观察时点细胞凋亡指数高于顺铂组(P<0.01)。⑤与对照组比较,顺铂组、含药血清组和含药血清+顺铂组中p-Akt、Bcl-2表达明显下降(P<0.01),P53、Bax、Caspase3表达显著增加(P<0.01)。结论食道通结方含药血清对食管癌TE-1细胞株的增殖和生长有一定的抑制作用,能够促进细胞凋亡,与顺铂联合后具有较为明显的协同作用。
肾细胞癌(简称肾癌)是肾肿瘤的最主要类型,也是死亡率最高的泌尿系肿瘤之一。对于晚期肾癌患者来说,治疗方法非常局限。要想找到针对肾癌的特异性治疗方案,需要对肾癌的生物学基础有着深入的理解。旨在回顾多年来肾癌基因组学的研究进展,从组学方面分析、解释肾癌的生物学基础,找到治疗靶点,实现针对肾癌患者的特异性治疗,从而推动科学研究向临床实践的转换。
慢性淋巴细胞白血病(chronic

很少 lymphocytic leukemia,CLL)是一种慢性淋巴细胞增殖性疾病,以成熟CD5+B淋巴细胞在外周血、骨髓、脾脏和淋巴结的大量聚集为特征。CLL是西方发达国家最常见的成人白血病类型,占所有白血病的30%,主要见于老年人,中位发病年龄为67~72岁,其中男性患者多于女性。CLL病程长短不一,长者可达数十年,短者仅1~2年。少数CLL患者可以发生Richter’s转化,转化为高度恶性的大细胞淋巴瘤。对于CLL患者,如何进行正确的危险分层并且有针对性的选择个体化治疗策略,是CLL临床治疗中的关键问题。
PI3K/Akt/mTOR信号转导通路可以通过调控基因表达,在肝细胞癌肿瘤细胞生成、增殖、转移和凋亡等过程中发挥重要作用。简述了PI3K/Akt/mTOR信号通路的组成及功能,对PI3K/Akt/mTOR通路在肝细胞癌进程中的作用机制及相关抑制剂的研究进展进行了综述,揭示阻断PI3K/Akt/mTOR通路可以成为肝细胞癌治疗新的靶点方向。
胃癌是消化系统常见的恶性肿瘤。随着细胞毒药物和分子靶向药物研究的快速发展,晚期胃癌患者姑息化疗取得一定进展。本文主要综合近年来的研究结果,阐述胃癌药分子靶向治疗的最新研究。
卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤之一。卵巢癌早期诊断困难,一旦确诊卵巢癌,75%的患者已是中晚期。目前国际上比较公认的卵巢癌化疗为紫杉醇联合铂类,但原发耐药和在治疗中产生的多药耐药导致晚期卵巢癌患者5年生存率仅为20%～30%。靶向药物治疗对卵巢癌个体化治疗提供可能,给卵巢癌患者提供了更大的治疗空间。
目的建立人子宫内膜癌孕激素耐药细胞株Ishikawa(ISH)/醋酸甲羟孕酮(MPA),为子宫内膜癌耐孕激素的发病机制提供基础。方法采用逐步递增MPA浓度方法进行Ishikawa细胞株耐药体外诱导。采用MTS法测定药物敏感性;绘制细胞生长曲线和计算群体倍增时间。结果 Epigenetics抑制剂 (1)成功建立了MPA诱导的人子宫内膜癌耐MPA细胞株ISH/MPA,其对MPA耐药指数为3.35;(2)ISH/MPA在含MPA 10μmol/L的培养基中的细胞倍增时间与Ishikawa在普通培养基中的倍增时间比较,差异无统计学意义(P>0.

05)。正常的大鼠角膜基质中几乎没有P-JNK的表达,创伤后表达明显增多,SP600125能够抑制创伤后JNK通路的活化。SP600125处理后,与对照组相比,创伤诱导的大鼠角膜基质中CTGF的表达受到明显抑制,而对TGF-β1的表达没有明显影响。TGF-β1及CTGF均能促进细胞增殖;而SP600125处理后,TGF-β1促THSF细胞增殖的作用受到明显抑制。TGF-β1作用于细胞后,THSF细胞中P-JNK蛋白表达较对照组明显上调。TGF-β1刺激组细胞划伤后迁移速度明显快于对照组,而SP600125预处理后明显抑制TGF-β1促进的细胞迁移能力。TGF-β1或创伤刺激THSF细胞24h后,CTGF、FN和Col

为什么 Iα1 mRNA在各组中均有表达,其中创伤和TGF-β1刺激组呈高表达,而SP600125处理组表达明显降低。 结论:JNK通路参与角膜创伤愈合过程,可能介导TGF-β1上调CTGF表达和促角膜瘢痕形成的过程,深入研究明确JNK通路的作用,有望为控制角膜瘢痕的形成提供新的途径。 第三部分:RNA干扰研究JNK通路介导角膜基质中TGF-β1调控CTGF表达的作用 目的通过前期实验(第一、二部分)研究发现,TGF-β1能够通过上调CTGF表达促角膜瘢痕形成,JNK通路可能介导了TGF-β1诱导CTGF表达的过程,本研究通过RNA干扰技术阻断JNK通路,研究TGF-β1调控CTGF表达促角膜瘢痕形成的作用机制。 材料和方法体外培养THSF细胞,针对人JNK1和JNK2基因cDNA序列设计JNK1、JNK2的特异性siRNA序列。用荧光标记的阴性对照siRNA筛选转染条件,转染试剂的浓度梯度为每350μl的体系中1-4μl。按照预实验筛选的转染条件将JNK1/2siRNA转染到无血清培养液处理过的THSF细胞中,24h后收集细胞进行抑制效应分析,荧光定量PCR检测JNK1和JNK2 和 mRNA的表达,以无血清DMEM及对照siRNA为对照。THSF细胞转染JNK1/2 siRNA成功后,采用TGF-β1(3ng/ml)或10μlTip枪头划伤刺激细胞,倒置显微镜下观察创伤愈合情况。刺激15min后采用免疫荧光检测P-NK1/2表达,24h后收集细胞检测CTGF mRNA和蛋白,Ⅰ型胶原蛋白的表达。 结果荧光显微镜观察见不同浓度的转染条件下荧光标记siRNA的转染效率均超过90%,每350μl体系中应用2μl转染试剂时转染效率最高,细胞状态好。JNK1/2siRNA转染THSF细胞后,荧光定量PCR结果示JNK1和JNK2的mRNA表达均受到明显抑制,抑制效率均超过80%。用Tip枪头划伤刺激THSF细胞后,JNK1/2siRNA干扰组细胞与对照组相比迁移速度明显减慢。免疫荧光结果显示TGF-β1刺激后,DMEM组及阴性siRNA对照组细胞中P-JNK表达明显增多,JNK通路活化;而JNK1/2

siRNh干扰组细胞中的P-JNK表达较对照组明显减少。TGF-β1及创伤刺激均能够明显促进THSF细胞中CTGF mRNA和蛋白的表达;RNA干扰在基因水平阻断JNK通路后,上调的CTGF表达受到明显抑制。此外,阻断JNK通路也能够抑制TGF-β1诱导的Ⅰ型胶原蛋白表达。 结论RNA干扰能够有效的阻断JNK通路;JNK通路介导TGF-β1调控的CTGF表达。
背景 代谢综合征(metabolic syndrome,MS)是向心性肥胖、高血糖、高血压和血脂紊乱等多种因素在个体聚集的症候群。随着MS发病率的急剧升高,由MS导致的心血管并发症也明显增多。MS各组成成分都是心血管病的危险因素,这些与代谢有关的多种疾病或致病因素同时出现在一个个体身上,其临床预后不良的危险大于仅有一种危险因素患者,而且其效应不是简单相加,而是协同加剧,严重危害人类健康。

左室肥厚是心血管事件的一项重要的独立危险因素。随着代谢性危险因素的增加,如高血压合并糖尿病、肥胖或血脂紊乱等,则左室肥厚更加明显。既往对单纯高血压和糖尿病引起的心脏损害研究较多,而少有关于MS心肌重构及其分子机制的报道。本研究在建立MS大鼠模型的基础上,明确MS多种代谢异常因素共同作用对心肌重构的影响,阐明其机制,并寻找能延缓或逆转MS心肌重构的药物。 MS的主要病理生理基础是胰岛素抵抗。随着MS发病机制研究的进一步深入,炎症在胰岛素抵抗及MS中的作用越来越受到重视。炎性因子激活的一系列激酶可以使胰岛素作用底物(insulin receptor substrate,IRS)丝氨酸/苏氨酸磷酸化,阻碍其正常的酪氨酸磷酸化。目前研究较多的炎症导致胰岛素抵抗的三条途径为IKK/NF-κB、JNK及SOCS-3途径。既往研究显示,胰岛素和胰岛素受体结合后主要通过两条途径将信号下传至效应器:其中之一是经IRS/PI3K/Akt通路。当胰岛素与受体的α亚基结合并改变了β亚基的构型后,酪氨酸蛋白激酶被激活,将IRS上具有重要作用的十几个酪氨酸残基磷酸化,磷酸化的IRS结合并激活下游效应物,即P13K/Akt通路,最后参与细胞代谢、生存/凋亡、分化和增殖等过程。但目前,关于MS患者炎症影响心肌胰岛素信号传导的研究较为少见。 寻找更多 黄连解毒汤(HLJDT)是清热解毒经典方剂,源于唐代王烹《外台秘要》,由黄连、黄岑、黄柏、桅子四味生药组成。研究表明,黄连解毒汤具有降糖、调脂、抗炎、改善胰岛素抵抗等作用,但黄连解毒汤对代谢综合征心肌重构的作用及机制研究较少。本研究旨在建立饮食诱导的MS大鼠模型,该模型具有人MS的许多相似特征。以此MS大鼠模型为研究对象,明确MS大鼠心脏结构和功能改变,探讨炎症导致MS心肌重构的可能机制,并研究黄连解毒汤对MS大鼠心肌重构的影响及其机制,从而为药物干预MS心肌重构,延缓心肌重构向心力衰竭的转化提供新思路。 目的 1.建立饮食诱导的MS大鼠模型。 2.观察MS大鼠模型心脏结构和功能的变化特点。 3.

05）；CT治疗组的MMP-13的表达也有明显升高（P<0.05），但与IL-1β诱导组比较，加入CT后MMP-13的表达明显下降（P<0.05）；CT治疗组p-P38的水平比空白对照组明显升高（P
骨肉瘤是最常见的原发性恶性肿瘤多见于儿童和青少年,取决于受影响的元素主要有三种类型,成骨细胞,软骨细胞和成纤维细胞。目前治疗骨肉瘤主要方法是手术和辅助化疗,尽管随着辅助疗法的进步,患者的生存率大幅提高,然而出现更多转移、化疗药物的耐药性及副作用导致患者的预后较差,因而迫切需要开发一个新的替代方案是十分必要的。本研究先用贝壳杉烷二萜类化合物冬凌草甲素联合COX-2抑制剂塞来昔布干预骨肉瘤细胞MG-63观察生长的影响,并以毛萼乙素和吗伐考昔为例进一步了解此两类化合物对骨肉瘤的作用机制。第一章：冬凌草甲素联合塞来昔布对人骨肉瘤MG-63细胞增殖及凋亡的影响目的：检测二萜类化合物冬凌草甲素联合COX-2抑制剂塞来昔布对人骨肉瘤MG-63细胞增殖及凋亡的影响,并探讨可能的作用机制。方法：MTT法检测不同浓度的冬凌草甲素和塞来昔布在各时间点单药和联合干预MG-63后细胞的增殖抑制率,流式细胞术检测冬凌草甲素和塞来昔布单药和联合干预MG-63后细胞的凋亡率,实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测COX-2和凋亡调节因子(Bc1-2、survivin和Bax)

mRNA及蛋白的表达水平。结果：冬凌草甲素、塞来昔布单药和联合干预后,骨肉瘤MG-63细胞的增殖明显受抑制,呈剂量依赖性,且两药有协同作用。冬凌草甲素、塞来昔布联合干预组较空白组和各单药组细胞的凋亡率增加。联合干预组较空白组和各单药组COX-2、Bcl-2和Survivin mRNA及蛋白的表达量明显下调,而Bax 购买GW-572016 mRNA及蛋白表达量明显上调。结论：冬凌草甲素联合塞来昔布可协同抑制MG-63细胞,这一过程可能与COX-2的表达受到抑制和凋亡调节因子(Bcl-2、Survivin 和 Bax)表达有关。第二章：ERK1/2信号通路介入毛萼乙素诱导人骨肉瘤MG-63细胞凋亡及自噬目的：探讨二萜类化合物毛萼乙素(EriB)对人骨肉瘤MG-63细胞增殖、凋亡及自噬的影响,并探讨可能的作用机制。方法：MTT法检测不同浓度的EriB在各时间点干预MG-63后细胞的增殖抑制率,流式细胞术检测EriB(1.5

μmol/L)干预MG-63后细胞的凋亡率。实时荧光定量PCR法检测EriB(1.5 μmol/L)单独干预和先用ERK1/2抑制剂U0126(50μmol/L)阻断30min后再用EriB(1.5μmol/L)干预MG-63后凋亡因子(Bcl-2和Bax)和自噬因子Beclin-1mRNA的表达水平。蛋白质印迹法检测EriB(1.5μ mol/L)在多个时间点干预MG-63后ERK1/2的磷酸化水平及EriB(1.5μmol/L)单独干预和先用U0126阻断30min后再用EriB(1.5μmol/L)干预MG-63后凋亡因子survivin和自噬因子LC3中LC3-Ⅱ蛋白的表达水平。结果：EriB干预后,骨肉瘤MG-63细胞的增殖明显受抑制,呈时间剂量依赖性。EriB干预后,MG-63细胞凋亡率增加。EriB单独干预组较空白组Bcl-2

Idelalisib浓度 mRNA和Survivin蛋白的表达量明显下调,而Bax和Beclin-1 mRNA及LC3-Ⅱ蛋白表达量明显上调；EriB干预后p-ERK1/2与ERK1/2的比值在6h达到峰值；U0126阻断后再用EriB干预组较EriB单独干预组Bcl-2 mRNA和Survivin蛋白的表达量明显上调,而Bax和Beclin-1 mRNA及LC3-Ⅱ蛋白表达量明显下调；U0126阻断后再用EriB干预组较U0126单独阻断组相关mRNA和蛋白的变化不明显。结论：毛萼乙素可抑制人骨肉瘤MG-63细胞增殖,诱导其凋亡和自噬,这可能与MAPK/ERK1/2信号通路的介入有关。第三章：P38信号通路介入吗伐考昔诱导的人骨肉瘤细胞MG-63凋亡目的：探讨一种长效环氧合酶-2(COX-2)抑制剂吗伐考昔,对体外培养的人骨肉瘤细胞MG-63生长的影响及可能的机制。方法：用MTT法检测不同浓度吗伐考昔在各时间点对MG-63细胞的生长抑制率,并观察其有效的作用浓度；蛋白质印迹法和实时荧光定量PCR法检测吗伐考昔单独干预M Ruxolitinib数据表 G-63细胞后凋亡调节因子Bcl-2、Bax和Survivin蛋白及mRNA的表达；蛋白质印迹法检测吗伐考昔干预MG-63细胞后P38蛋白的表达。结果：吗伐考昔可抑制MG-63细胞的增值。吗伐考昔干预MG-63细胞可引起凋亡调节因子Bc1-2、Survivin蛋白及mRNA的下调,Bax蛋白及mRNA的上调。吗伐考昔干预MG-63细胞可促使P38信号通路蛋白的活化。结论：吗伐考昔可通过诱导MAPK通路P38活化而影响人骨肉瘤细胞MG-63凋亡。
背景与目的卵巢癌是全球范围内最常见的女性生殖系统肿瘤性疾病之一,其发病率仅次于鳞状细胞宫颈癌和子宫内膜癌而位居第三位,但其死亡率极高,接近65%,位居各类妇科肿瘤的首位,其中约半数以上患者因该病复发或在治疗过程中死亡。上皮性卵巢癌是卵巢肿瘤疾病中发病率最高的病理类型,约占总发病例数的85%~90%,并且患者极易发生死亡,尽管70%以上的患者均接受了外科手术治疗和标准的化学治疗,5年生存率依然很低。这些可能与卵巢癌的高度易转移性、某些细胞存在化学治疗抵抗性以及卵巢复杂的胚胎发育、组织解剖和内分泌功能有关。因此,深入研究卵巢癌的病因及发病分子机制对于临床卵巢肿瘤疾病的诊断、防治和预后工作具有深远的意义。阿司匹林是一种临床上使用非常广泛的非甾体抗炎药,常用于骨关节炎、类风湿性关节炎、各种发热和疼痛、动静脉血栓形成、凝血功能异常等疾病的治疗。到现在为止,阿司匹林抗肿瘤作用的具体分子机制仍然未清晰。此外,阿司匹林对多种人类肿瘤疾病的预防和治疗均有着积极的辅助意义,其在抗肿瘤研究中的巨大潜力应引起广泛的重视。SOX7基因定位于人类染色体8p23.

7拟南芥35S::GmZnFl生理实验指标测定 在2.0μM ABA,200mM NaCl,250mM甘露醇以及4.0℃冷胁迫条件下,转基因株系的SOD, POD, CAT,丙二醛和脯氨酸,与对照组相比均有不同程度的升高,揭示转基因系对这些逆境有一定的抗性,细胞结构更加稳定,膜系统不易降解。 1.8大豆转化与检测 使用含有目的基因的表达载体的农杆菌,使用组培方法转化大豆,然后对T1代植株进行检测：其中的35S::GmZnF1阳性植株,利用CTAB法提取DNA,进行Southern Blot检测。结果表明,在收获的T1代植株300棵植株中,共有阳性植株6棵,阳性比例2.0%,检测为阳性植株中的该目的基因都是单拷贝插入基因组。 Epigenetics抑制剂 2GmPK6的获得与初步功能分析 2.1GmPK6基因的芯片结果验证 RT-PCR分析表明,GmPK6基因在盐胁迫下,表达量随着胁迫时间的延长而逐渐增加。 2.2GmPK6蛋白结构、性质及系统进化分析

GmPK6基因编码的蛋白蛋白激酶,属于LAMMER类型的亚家族。结果显不：GmPK6与Glycine max PKC-like, Arabidopsis thaliana AFC2, Arabidopsis thaliana FUS3和烟草PK12的同源性较高(～100.0%),其次是与蓖麻AFC有同源性(43.0%)。 2.3GmPK6蛋白表达 克隆含有酶切位点的基因GmPK6,使用pGEX GST4T-1载体构建重组载体,并且转化Rosseta菌株。PCR检测阳性菌株,二次活化后,取出适量菌液作为0hr对照组,其余菌液中加入IPTG(终浓度1.0mM),28.0℃摇菌诱导目的蛋白表达,并且在3hr,6hr和8hr时间点分别取样。SDS-PAGE电泳表明,目的蛋白在3h开始表达,表达量随时间逐渐增多。 MK-8776细胞系 2.4GmPK6表达模式分析 qPCR结果表明,GmPK6在大豆的根、茎和叶片中表达量最高,在花和种子中表达量很低；而且GmPK6明显受ABA、盐、干旱和冷胁迫的诱导。 2.5GmPK6的克隆及拟南芥过表达株系的获得 从“圣豆9号”中首次分离了1个蛋白激酶基因CDS序列,命名为GmPK6,序列长度分别为1419bp,分别编码473个氨基酸。 克隆了GmPK6基因CDS全长,构建了植物表达载体,并转化拟南芥野生型植株,得到此基因的过表达纯系。 2.6拟南芥GmPK6过表达系的抗逆性分析 比较不同盐浓度梯度下种子萌发率,发现随着盐浓度的升高,过表达系的萌发率高于野生型的趋势越来越明显,并且差异显著。比较在不同盐浓度下的主根平均长度发现,在含有150mM以及200mM氯化钠的1/2MS培养基上,过表达系植株的主根长度比野生型植株的有显著增长。 叶片失水率结果显示,35S::GmPK6过表达系植株叶片的失水率低于野生型,揭示转基因株系的植株有较强的保水能力。 拟南芥35S::GmPK6系耐冷性分析结果显示,植株在10h冷胁迫处理(4.0℃)后表现出明显的耐冷性,存活率与对照组相比有显著提高。 2.7拟南芥35S::GmPK6生理实验指标测定 在2.0μM ABA,200mM NaCl,250mM甘露醇以及4.0℃冷胁迫条件下,35S::GmPK6转基因株系的SOD,POD,CAT,丙二醛和脯氨酸,与对照组相比均有不同程度的升高,揭示转基因株系对这些逆境有一定的抗性,细胞结构更加稳定,膜系统抗氧化能力增强。

2.8大豆转化与检测 使用含有目的基因的表达载体的农杆菌,使用组培方法转化大豆,然后对T1代植株进行检测：其中的35S::GmPK6阳性植株,利用CTAB法提取DNA,进行Southem

Blot检测。结果表明,在收获的T1代植株800棵植株中,共有阳性植株20棵,阳性比例2.5%,检测为阳性植株中的该目的基因都是单拷贝插入基因组。
背景与目的： 肺癌是全球范围内发病率及死亡率最高的恶性肿瘤之一。美国数据统计,在2009年美国大概有219440人患有肺癌,而将近159390人死于该疾病,而全球每年约有130万人死于肺部肿瘤。因肺癌大多发病隐匿,大部分患者确诊时已属晚期,失去手术机会。当前,恶性肿瘤的治疗主要采用手术治疗、放化疗等方法。随着分子生物学及药理学的发展,生物治疗、靶向治疗及多学科的综合治疗已成为抗肿瘤研究的热点。而且大量数据证实,抗肿瘤化疗药物毒副作用大,且长期用易产生耐药性等劣势。近年来中医中药抗肿瘤越来越受到国内外医药界的关注。诱导肿瘤细胞的凋亡视为治疗肿瘤疾病的主要目标和手段。扶正消癌合剂是导师多年经验用方,临床研究表明它能改善晚期肺癌患者的临床症状,增强机体免疫功能,提高生存质量等。但是具体作用机制还不明确。本实验采用血清药理学方法,研究扶正消癌合剂对人肺腺癌A549细胞凋亡的影响并探讨可能存在的发生机制,为其临床应用提供可能的理论和实验依据。 方法： 雄性SD大鼠60只随机分为6组(每组10只,组间体重无差别),分别是扶正消癌合剂低剂量、中剂量和高剂量组,DDP组,中药联合DDP组,生理盐水组,中药组按照人与鼠体表面积换算法及血清药理学实验方法,分别给予扶正消癌合剂低、中、高剂量灌胃药液灌胃,DDP组给予腹腔注射0.5mg/ml的DDP,中药联合DDP组予扶正消癌合剂中剂量灌胃药液灌胃及腹腔注射0.5mg/ml的DDP,生理盐水组予0.9%氯化钠溶液灌胃。均连续给药7天,每天2次,每次2m1。末次灌胃后2h后水合氯醛腹腔注射麻醉,无菌条件下腹主动脉采血,分离血清,56℃灭活30min,经0.22μm过滤除菌,-20℃保存备用。制备大鼠含药血清,MTT法检测扶正消癌合剂含药血清对人肺腺癌A549细胞增值的影响。Annexin AUY-922 V-FITC/PI双染法流式细胞术观察含药血清对A549细胞凋亡的影响。Western-Blot检测含药血清对P53, Bcl-2及Survivin蛋白表达的影响。 结果： 1.倒置显微镜下观察,正常A549细胞呈贴壁生长,多为梭形或椭圆形,胞浆透亮饱满,细胞增殖速度快。扶正消癌合剂含药血清作用48h后,可见空白对照组细胞状态生长良好。而中剂量组部分细胞的形态变为圆形,细胞间隙些许增大,高剂量组和DDP组,细胞体积变小,细胞间隙较宽,少部分细胞出现脱落。观察到联合组的细胞出现脱落,部分细胞肿胀、破碎,呈坏死状态。并且药物作用72h后细胞数量明显减少,细胞凋亡更加显著。 2.不同浓度的中药含药血清作用于人肺腺癌A549细胞24h、48h、72h,对细胞有明显的抑制功能。随着含药血清药物浓度的增加、时间的延长,抑制作用则增强,呈现时间及剂量相关性,并且高浓度组抑制率仅次于DDP组,联合组抑制率最高,高达38.68%,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。作用96h后,抑制率反而下降。可见药物作用最佳时间和药物浓度。 3. Western blot检测结果,与空白对照组比较,随着药物浓度增加,bcl-2蛋白及Survivin蛋白水平逐渐降低(P＜0.05),而P53蛋白的表达水平则呈增加趋势(P＜0.

8%,共4.38%经粪便排泄。仅有少量VBE-6(0.34%)以原型药物形式经粪便排泄。 对VBE-6及其三个代谢产物进行的体外乳腺癌MCF-7细胞抗肿瘤试验结果表明,三个代谢产物均保持较强的抗肿瘤活性,与母药VBE-6活性相近。 因此,本课题完成了VBE-6的合成制备工艺建立,并对其大鼠体内进行了研究,结果表明,与VBE-1相比,大鼠口服给药VBE-6后,在体内不经历代谢失活历程,体外抗人乳腺癌MCF-7细胞试验中代谢产物依然保持较强的抗肿瘤活性。本课题的代谢数据将对VBE-6的临床前药理学及毒理学等方面的研究起到很好的辅助及补充作用,并为VBE-6抗肿瘤机制的深入研究提供基础,对开发应用前景良好的候选药物VBE-6具有深远的意义。
细胞信号转导在细胞的代谢、分裂、分化、生物功能及凋亡过程中起着重要作用,肿瘤的发生和发展与细胞的过度激活有关。PI3K/Akt信号通路作为细胞内重要信号转导通路之一,通过影响下游多种效应分子的活化状态,在细胞内发挥着抑制凋亡和促进增殖的关键作用。由于PI3K是肿瘤的一个重要靶点,PI3K抑制剂的研究吸引了广泛的关注。近年来,数个PI3K抑制剂已经进入临床研究阶段,包括PX-866、SF-1126、NVP-BEZ235、XL-147、GDC-0941、ZSTK474、GSK-615和GSK2126458。

噻吩并[3,2-d]嘧啶系列衍生物,作为一类新型PI3K制剂已经被广泛研究。通过对这些化合物的合成和生物活性的研究发现,GDC-0941具有很好的活性,其抑制活性分别为IC50=3、33、3和75 nM(PI3Kα、β、δ和γ),现正处于Ⅰ期临床研究阶段。我们以GDC-0941为先导物,用各种取代的三氮唑基替换了GDC-0941分子中噻吩环系上的4-甲磺酰哌嗪-1-基亚甲基结构,主要是考察芳杂环能否代替非芳香性的哌嗪基团,同时在三氮唑基团的侧链中引入叔胺片段以保持化合物的水溶性,此外对GDC-0941的吲唑环进行结构修饰,希望找到可以理想的替代基团。基于以上考虑,我们合成了一系列GDC-0941的类似物(TM1～16)。通过高效液相色谱、核磁共振谱、质谱等分析方法验证了类似物。并进行了体外抗肿瘤活性评价,期望从中筛选出活性优于GDC-0941的新型抗肿瘤候选药物。 购买GSK2656157 药理试验结果显示,与GDC-0941相比,大部分类似物显示了较强的抗癌活性,其中活性较好的化合物进行了小鼠体内药物代谢实验,但结果不是很理想,进一步的研究还在继续进行。
背景 无 5-FU是临床常用的广谱抗肿瘤药,主要通过干扰肿瘤细胞的DNA合成而杀死肿瘤细胞,但同时也杀伤机体正常细胞,从而引起诸多不良反应,如胃肠道损害、骨髓抑制、神经系统损害等。去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)主要表达于肝细胞表面,可特异识别去唾液酸糖蛋白的半乳糖残基而将其内吞清除。继而的研究发现,某些肿瘤细胞表面,如HepG2、Caco-2、HT-29细胞等,ASGPR高表达,因此,以去唾液酸糖蛋白受体为靶点研究抗肿瘤靶向药物成为目前的研究热点。目前这类药物大多数都是以携带有半乳糖基的载体为递药系统,将抗肿瘤药包裹或吸附,将药物转运到达肿瘤组织而释放,实现靶向抗肿瘤作用。但以化学合成方法,将药物以半乳糖残基修饰,靶向肿瘤组织,提高肿瘤局部浓度,达到肿瘤靶向效果的研究少见。因此,本研究拟采用半乳糖与5-FU共价结合,形成5-FU半乳糖苷,通过研究5-FU半乳糖苷的体内外抗肿瘤作用及其肿瘤靶向性,以期为肿瘤治疗及肿瘤靶向药物研发提供实验依据,用于肿瘤治疗。

方法 采用本实验室设计合成的5-FU半乳糖苷,进行体内、外抗肿瘤及肿瘤靶向研究: 1.体外抗肿瘤及肿瘤靶向研究:选取去唾液酸糖蛋白受体表达量不同的HepG2、Caco-2、A549细胞,采用MTT法观察5-FU及5-FU半乳糖苷对其增殖抑制作用,并计算其IC50值;将Caco-2细胞与5-FU及5-FU半乳糖苷分别孵育后,采用HPLC方法于2、5、10、15、30、60、120分钟检测活细胞内5-FU及5-FU半乳糖苷的摄取情况; 2.体内抗肿瘤及肿瘤靶向研究:采用皮下注射肿瘤细胞悬液的方法,建立HepG2荷瘤小鼠模型,饲养于SPF环境,观察肿瘤生长情况,待肿瘤生长至0.5×0.5 cm左右大小,随机分为模型组、5-FU组(0.2 mM/kg)及5-FU半乳糖苷0.2、0.1和0.05

mM/kg组。尾静脉给药,隔天1次,连续2周。给药治疗期间,观察小鼠一般状态,记录小鼠体重、肿瘤体积变化。停止给药后再连续观察一周。一周后,尾静脉再次给予5-FU及5-FU半乳糖苷,15分钟后收集小鼠静脉血,处死小鼠,分离小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、肠及肿瘤,称重,保存于冰浴。采用血球计数仪检测小鼠血常规;分离血浆,各组织器官匀浆,提取药物,以HPLC方法检测5-FU及5-FU半乳糖苷在血浆、肿瘤及各组织中的分布浓度。 点击此处 结果 1. western blotting结果显示:HepG2、Caco-2细胞有较高水平的去唾液酸糖蛋白受体表达,而A549细胞几乎无去唾液酸糖蛋白受体表达; 2.体外细胞增殖抑制试验表明:5-FU半乳糖苷对HepG2、Caco-2细胞增殖具有明显抑制作用,呈剂量依赖性,且作用较5-FU强;而5-FU半乳糖苷对A549细胞增殖亦有明显抑制作用,呈剂量依赖性,但与5-FU相比无明显差别。其中5-FU的IC50,HepG2:5.95×10-6 M/L,Caco-2:3.17×10-6 M/L,A549:6.24×10-6 M/L; 5-FU半乳糖苷IC50,HepG2:2.75×10-7 M/L,Caco-2:1.75×10-7 M/L,A549:6.05×10-6 M/L。 3.体外细胞靶向结果显示:Caco-2细胞对对5-FU半乳糖苷的摄取量较5-FU明显增多,其摄取量在一定时间内均呈时间依赖性,60 min后细胞摄取量达到饱和。 4.体内抑瘤结果显示:5-FU半乳糖苷可显著抑制裸鼠移植瘤生长,且呈剂量依赖性,同等剂量作用明显强于5-FU;5-FU半乳糖苷对裸鼠体重和血象无明显影响,毒性较小;而5-FU则显著降低裸鼠体重和荷瘤小鼠的血象,毒性较强。 5.体内组织靶向结果显示:末次静脉给药第15分钟后,5-FU半乳糖苷在荷瘤小鼠肿瘤组织的分布浓度较5-FU高。 结论 1.5-FU半乳糖苷对高表达去唾液酸糖蛋白受体的肿瘤细胞生长抑制作用较5-FU显著增强,其可能机制是细胞表面的去唾液酸糖蛋白受体可显著增加其对5-FU半乳糖苷的摄取。 2.与5-FU相比,5-FU半乳糖苷不仅可明显抑制裸鼠移植瘤的生长,且显著降低全身毒性及骨髓毒性,可能机制是含半乳糖基的5-FU半乳糖苷具有较高的肿瘤靶向性。 3.

05或p<0.01),但是肾重与体重比值略有降低(p<0.01)。与糖尿病组(diabetesgroup)相比,糖尿病治疗组(pp2group)的体重、摄食量略有升高(p<0.01),肾重、肾重与体重的比值以及24h尿量明显下降(p<0.05或p<0.01)。(2)与正常对照组(controlgroup)相比,糖尿病组(diabetesgroup)的血糖、血清肌酐、尿素氮、甘油三酯、低密度脂蛋白和24h尿白蛋白明显升高(p<0.01)。与糖尿病组(diabetesgroup)相比,糖尿病治疗组(pp2group)的血糖、血清肌酐、尿素氮和24h尿白蛋白均明显下降(p<0.05或p<0.05或p<0.05或p<0.01);p38mapk活性在高糖刺激12h开始升高,至少持续48h以上(p<0.05或p<0.05或p<0.01)。与hg组相比,sb203580(hg+sb203580组)能够明显降低pparγ、chop蛋白质表达(p<0.01)。(2)与ng组相比,高糖培养(hg组)hk-2细胞48h的egfr磷酸化水平(活性)明显升高(p<0.01)。与hg组相比,pp2(hg+pp2组)能够明显降低egfr磷酸化水平(活性)(p<0.01)。ng组和m组之间的egfr磷酸化水平(活性)无显著差异。(3)与ng组相比,高糖培养(hg组)hk-2细胞48h的egfr磷酸化水平(活性)明显升高(p<0.01)。与hg组相比,ag1478(hg+ag1478组)能够明显降低egfr磷酸化水平(活性)(p<0.01)。与HG组相比,AG1478(HG+AG1478组)能够明显降低GRP78和CHOP蛋白质表达(P<0.05或P<0.01)。与HG组相比,EGFR抑制剂AG1478明显改善高糖对细胞活性的抑制作用(P
Wip1(Wild

没有 type p53-induced protein phosphatases,野生型p53诱导的蛋白磷酸酶1)隶属于苏氨酸/丝氨酸PP2C蛋白家族,在脑胶质细胞瘤、乳腺癌、膜腺神经内分泌肿瘤等多种恶性肿瘤中均有异常表达,是一种新发现的原癌基因。研究表明Wip1基因的表达依赖于p53蛋白的活化,而其Wip1蛋白的过表达能使活化的p53蛋白去磷酸化和减少p53基因选择性突变,从而发挥其原癌基因功能。乳腺癌、脑胶质细胞瘤等恶性肿瘤中Wip1的异常表达能影响患者预后并提高肿瘤对抗癌药物的耐受性。但目前关于Wip1与宫颈癌的相关研究较少,特别在宫颈癌的辐射敏感性方面还未有报道。基于现状,本研究以Wip1为切入点,首次探讨Wip1对宫颈癌He

La细胞生物学行为和辐射敏感性的影响,并阐明相关分子机制,以期为Wip1作为宫颈癌的放疗增敏靶点提供实验基础和理论支持,也为宫颈癌患者的个性化治疗提供新的治疗靶点。目的:阐述干预Wip1基因在增强宫颈癌细胞系He La细胞的辐射抗性过程中的作用及其机制,并探讨干预Wip1在宫颈癌治疗过程中的作用方法:(1)本研究采用的照射条件为:GC3000 Elan辐射器(MDS Nordion,加拿大),单次受照剂量2~3 Gyγ-射线。(2)应用Western bolt法检测不同宫颈癌细胞株中Wip1表达水平;(2)MTT法检测不同细胞株细胞增殖活性;(3)分别构建pc DNA3.1-Wip1和si RNA-Wip1重组质粒,将其转染入人宫颈癌细胞系He www.selleckchem.cn/products/ly2109761.html La细胞,构建空载体细胞、si

Wip1细胞和si Wip1+过表达Wip1细胞;(4)实时定量PCR法检测稳定转染细胞Wip1 m RNA表达量;(5)Western blot法检测稳定转染细胞Wip1蛋白表达量;(6)平板克隆形成实验检测He Buparlisib供应商 La细胞的放射敏感性;(7)流式细胞仪检测He La细胞凋亡水平;(8)彗星实验检测细胞在γ线照射后不同时间He La细胞的DNA片段分布,观察He La细胞的DNA损伤、修复情况;(9)Western blot法检测He La细胞p38,p-p38,p53和p-p53表达水平;(10)采用p38MAPK抑制剂SB203580预处理He La细胞,评价p38MAPK信号通路与He La辐射敏感性的关系;(11)应用Image J软件对蛋白电泳条带做灰度分析;(12)Student’s t-test用于分析数据,p0.05)。3、沉默Wip1表达上调He La的辐射敏感性si Wip1细胞于转染后48 h起增殖速度显著降低并呈下降趋势,其72 h、96h细胞数目显著低于空载体细胞和si Wip1+过表达Wip1细胞,差距有统计学意义(P0.05);克隆形成数目和半径结果与之类似;细胞凋亡水平与之相反。联合γ-射线辐射时,si Wip1细胞克隆数目和克隆半径显著低于空载体细胞和si Wip1+过表达Wip1细胞,差距有统计学意义(P0.05);细胞凋亡水平与之相反。4、沉默Wip1表达下调辐射条件下He La细胞的DNA损伤修复与空载体细胞和si Wip1+过表达Wip1细胞相比,si Wip1细胞DNA损伤程度较重,表现在彗星头部DNA百分比明显减少,而彗星尾部的小片段破损DNA百分比明显升高,差距有统计学意义(P0.05)。5、Wip1与p38MAPK信号通路中蛋白表达相对于空载体细胞和si Wip1+过表达Wip1细胞,si Wip1细胞p-p38、p53和p-p53的表达水平显著降低(P<0.05,P<0.01,P0.05)。而三组细胞中p38表达水平没有显著差别(P>0.05)。当预处理SB203580时,si Wip1+SB20358细胞相对于si Wip1细胞p-p38、p53和p-p53的表达水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01,P0.05),三组细胞p38水平没有显著差别(P>0.05)。6、SB203580逆转Wip1提高了细胞的辐射敏感性当预处理SB203580时,si Wip1+SB203580细胞和空载体细胞的克隆数目、克隆半径和凋亡水平相近,差异没有统计学意义(P>0.05);当联合γ-射线辐射时,si Wip1+SB203580细胞和空载体细胞的克隆数目、克隆半径和凋亡水平同样相近(P>0.05),表明SB203580逆转沉默Wip1能提高细胞的辐射敏感性。结论:1.Wip1在宫颈癌He La细胞的放疗敏感性中发挥重要的调节作用,沉默Wip1表达可以使γ-射线辐射后He La细胞细胞增殖、克隆形成和抗凋亡能力降低;2.Wip1能增强γ-射线辐射所引起的He La细胞DNA损伤的修复,从而增强其放疗耐受性;3.

Using 5HT transport assays, we found that IL-1β and

TNF -α stimula…
目的研究急性肾损伤时心肌损伤与TNF-a IL-6及caspase-9的表达的变化揭示在急性肾损伤时导致心肌损伤机制。方法35只SD大鼠随机分为5组,正常对照组,肾动脉结扎组,SB203580+肾动脉结扎组,内毒素组,内毒素+SB203580组,每组7只。采用结扎双侧肾动脉建立急性肾损伤模型,分别观测各组血清中和心肌组织匀浆上清液中的TNF-a IL-6和caspase-9的表达情况。结果急性肾损伤组较对照组明显表达增高(P<0.001)。SB203580治疗后表达减轻。而对比内毒素中的表达,急性肾损伤较轻。结论急性肾损伤时血引起的炎症反应可能导致心肌的损伤,尽早进行抗炎治疗可能有助于防...
目的:探讨N-乙酰半胱氨酸(NAC)在高氧性肺损伤的保护作用,并研究p38MAPK信号途径在NAC干预高氧性肺损伤中表达的变化。方法:40只3周龄普通级Wistar大鼠随机等分为5组:空气组(A组)、高氧损伤组(B组)、高氧+NAC组(C组)、高氧+SB203580组(D组)、高氧+NAC+SB203580组(E组)。光镜下观察肺组织形态改变,并测定肺湿/干重(W/D)比,采用免疫组化检测p38在肺组织中的分布,Western Blot检测p38 MAPK蛋白表达变化。结果:与A组比较,B、C、D、E各组均有不同程度的肺损伤,但干预后C、D、E各组较B组肺损伤有所减轻;免疫组化显示B、C、D、…
Background 没有 Build artificial skin photodamaged model.Explicit the cross talk between TGF- beta /Smad and ERK or P38MAPK signaling pathways in photodamaged artificial skin modle. Methods Epidermis were obtained by human epiderm keratinocytes cultured by human dermal fibroblasts feeder layer.Mixed m…
Aim:p38 mitogen activated protein kinase(MAPK) plays mTOR抑制剂 an important role in the mechanisms of sulfur mustard(SM)-induced injure.Inhibition of p38 suppressed

SM-induced inflammation and tissue injury in vitro.Our study was to evaluate the effect of two sorts of p38 MAPK inhibitor SB203580 and B1RB79…
目的:研究发现,p38MAPK参与辐射引起的细胞损伤过程。本研究给与受照小鼠p38抑制剂SB203580(SB),观察抑制p38通路对辐射诱导的免疫细胞功能改变的影响,并探讨与GSF的联合作用。方法:C57BL/6小鼠分为对照组、照射组、GSF组、SB组和GSF+SB组。对照组接受假照射,其余接受2Gy或4Gy全身照射,剂量率0.8Gy/min。GSF腹腔注射,1ug/次,2次/日,照射后2h开始给药,连续给药5日,SB203580 15mg/kg腹腔注射,照射24h后开始给药,隔日给药共给药5次。SB末次给药24h后处死小鼠,取外周血进行分型CD4、CD8、CD25、B220、NK1.1检测…
气道黏液高分泌是哮喘的主要症状之一,是患者肺功能进行性恶化的独立危险因素。其病理基础是气道上皮杯状细胞增生并合成大量黏蛋白MUC5AC。因此,探讨MUC5AC合成的分子机制及防治方法是近年哮喘研究的热点之一。p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase,p38 MAPK)是细胞内的主要信息传递分子,可将促炎因子等胞外
目的:造血干细胞(HSC)是目前治疗多种疾病的工具之一,但是数量的相对不足限制了其临床应用。应用生长刺激因子体外扩增HSC可以一定程度上获得HSC数量上的增加,但是传统的HSC扩增培养体系却使得HSC一部分重要生理功能丢失,如长期植入能力以及各系列血细胞重建能力。通过抑制p38

MAPKα可以抑制HSC扩增过程中的衰老,促进HSC的体外扩增,并增强扩增HSC的体内造血重建功能。本文我们试图探讨mTORC1在小鼠HSC体外扩增过程中的作用以及与p38 MAPKα的相互关系。
目的前期研究证实BMP-13可以诱导C3H10T1/2细胞向心肌样细胞分化,为进一步对其诱导和调控机理进行研究,本研究探讨p38丝裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)信号通路在BMP-1 3诱导C3H10T1/2细胞向心肌样细胞分化过程中的作用。方法利用BMP-13重组腺病毒质粒和GFP重组腺病毒质粒分别感染C3H10T1/2细胞24h后,通过Western blot技术检测磷酸化P38MAPK和总P38MAPK蛋白表达变化。p38干扰腺病毒(Ad-si-p38)和对照腺病毒(Ad-si-NC)分别感染C3H10T1/2细胞24h后,Western blot检测总P38MAPK的蛋白表达水平。A…
目的探讨p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)通路在络气虚滞型血管内皮功能障碍模型大鼠血清诱导的内皮细胞纤维状肌动蛋白(F-actin)表达中的作用及通络药物保护血管内皮,防治血管病变的作用机制。方法首先建立络气虚滞型血管内皮功能障碍(VED)大鼠模型,用模型大鼠血清体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)细胞株,实验分为5个组:空白对照组、正常血清组、模型血清组、通心络(TXL)组、SB203580组。采用Westem 5-Fluoracil研究购买 blot技术检测各组中F-actin、p38、磷酸化p38(phospho-p38)蛋白表达的变化。结果与空白对照组和正常血清组比较,模型血清组F-actin的蛋白表达明…
目的:研究MAPK、PI3K/AKT信号通路对纤维化蛋白(FBRS)诱导人肝星状细胞活化的调控作用。方法:体外培养LX-2人肝星状细胞株,予FBRS(终浓度10 ng/ml)刺激12 h、24 h、48 h或予FBRS(终浓度10ng/ml、100 ng/ml)刺激24 h;LX-2细胞分别先经MAPK、PI3K/AKT信号通路抑制剂SB203580(1uM)、SP600125(100nM)、U0126(150nM)和Ly294002(25uM)预处理1h,再予10ng/mlFBRS
目的探讨p38MAPK和c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路在脂多糖(LPS)诱导血脑屏障(BBB)的破坏中的作用。方法 1.

0统计软件进行数据分析,计量资料用均数士标准差(X±S)表示。两样本比较采用独立样本t检验,多个样本均数的比较采用单向方差分析(one-way ANOVA)。根据方差齐性检验结果,如方差齐时多重比较采用LSD(Least-significant-Difference)方法检验；如方差不齐时方差分析采用Welch法校正的近似F检验,多重比较采用Dunnett’s T3方法检验。检验水准为a=0.05。结果 1.龟板对K562和人红系细胞珠蛋白基因表达及HbF合成的作用 1.1龟板诱导K562细胞向红系分化 联苯胺染色结果显示不同浓度龟板作用于K562细胞,各浓度组中以龟板5mg/ml组的BZ%值最高,峰值在96h BZ%达11.72±0.68%,与未加药组(2.47±0.20%)相比差异有显著性意义(P<0.05)；龟板诱导K562细胞72h、96h、120h后α珠蛋白基因mRNA表达水平分别为未加药组的0.63±0.02、0.62±0.02、0.50±0.01倍,诱导前后差别有显著性意义(P0.05)。证明龟板对K562细胞γ珠蛋白基因表达有上调作用,对a珠蛋白基因表达有下调的作用,对p珠蛋白基因的表达没有影响。 1.2.2龟板对地贫病人外周血培养的红系细胞珠蛋白基因表达作用：龟板诱导不同地贫病人外周血培养的红系细胞Y珠蛋白基因!mRNA表达水平升高为未加药组的4.94±1.17倍,诱导前后差别有显著性意义(P
目的：长期以来糖皮质激素（glucocorticoids, GCs）作为重要抗炎药物用于炎症性肺病（inflammatory lung disease, ILD）的治疗。ILD是由于炎症、免疫等各种因素导致肺及支气管内大量巨噬细胞、中性粒细胞等炎症细胞浸润，释放大量炎症介质产生瀑布级联，进而引起肺内炎性介质和抗炎介质失衡造成的肺脏疾病。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），可以通过刺激机体各种免疫细胞产生大量的细胞炎性介质，进而诱发ILD。肺泡巨噬细胞(alveolar

无 macrophages，AMs)是LPS的主要效应细胞，释放内源性炎症因子产生瀑布级联是导致炎症发生、发展的根本原因。信号转导转录激活子-3（Signal transducers and activators of transcription-3,STAT3）的激活在调控ILD起着关键的作用。抑制丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号转导通路能减少致炎症细胞因子的释放。本实验以小鼠AM为研究对象，观察激素与p38MAPK特异性抑制剂SB203580对LPS刺激的上述细胞分泌TNF-α、IL-10的影响，分析两者是否存在协同作用并进一步探讨STAT信号途径在其中的作用，为临床应用激素及p38MAPK抑制剂治疗ILD提供理论基础。

方法： 1.ELISA检测LPS刺激细胞上清液中的TNF-α浓度。培养MH-S细胞株，调节细胞浓度到1×10~6/ml，于24孔板中培养过夜，随机分组：①对照组：加入与各实验组体积相同的无血清RPMI1640培养液；②LPS+Dex组：终浓度为1×10~(-6)mol/L的DEX预孵育2h后LPS刺激2h、6h、12h；③Dex组：终浓度为1×10~(-6)mol/L的DEX刺激2h、6h、12h；④Dex+SB203580+LPS组：终浓度为1×10~(-6)mol/L的DEX预孵育2h后，终浓度为10μmol/L的SB203580预孵育20min后LPS刺激2h、6h、12h；⑤LPS+SB203580组：终浓度为10μmol/L的SB203580预孵育20min后LPS刺激2h、6h、12h；⑥LPS组：终浓度为100ng/ml的LPS刺激2h、6h、12h。 各组细胞刺激成功后取上清液， 不 ELISA测定细胞上清液中TNF-α的含量。 无 2. ELISA检测LPS刺激细胞上清液中的IL-10浓度。方法及分组同TNF-α测定。 3.免疫细胞化学法检测MH-S细胞中p-STAT3的表达。将MH-S细胞于24孔板中进行爬片，调节细胞浓度到1×106/ml，培养过夜，随机分组：①对照组：加入与各实验组体积相同的无血清RPMI1640培养液；②LPS+Dex组：终浓度为1×10~(-6)mol/L的DEX预孵育2h后，LPS刺激30min；③Dex组：终浓度为1×10~(-6)mol/L的DEX刺激30min；④Dex+SB203580+LPS组：终浓度为1×10~(-6)mol/L的DEX预孵育2h后，终浓度为10μmol/L的SB203580预孵育20min后，LPS刺激30min；⑤LPS+SB203580组：终浓度为10μmol/L的SB203580预孵育20min后，LPS刺激30min；⑥LPS组：终浓度为100ng/ml的LPS刺激30min。各组MH-S细胞刺激成功后，用免疫细胞化学法检测各组细胞中的p-STAT3表达变化。

4.Western blot方法检测MH-S细胞内p-STAT3、STAT3的表达。实验分组同免疫细胞化学法，于6孔板中上述各组细胞刺激成功后收集细胞，检测细胞内p-STAT3、STAT3表达。 数据以均数±标准差()表示，各组比较用单因素方差分析(Oneway ANOVA)，各组之间进一步用Student-Newman-Keuls(SNK-q)检验进行两两比较分析是否有显著性差异，P<0.05)；DEX预处理后，抑制LPS诱导的TNF-α增加，与LPS组在2h、6h、12h分别比较差异有统计学意义(P<0.05)；SB203580预处理后，抑制LPS诱导的TNF-α增加，与LPS组在2h、6h、12h分别比较差异有统计学意义(P<0.05)；DEX和SB203580共同预处理后发挥协同作用，进一步抑制LPS诱导的TNF-α增加，与DEX+LPS组在2h、6h、12h分别比较差异有统计学意义(P<0.05)，与SB+LPS组在2h、6h、12h分别比较差异也有统计学意义(P<0.05)；DEX预处理后，抑制LPS诱导的IL-10增加，与LPS组在2h、6h、12h分别比较差异有统计学意义(P<0.05)；SB203580预处理后，抑制LPS诱导的IL-10增加，与LPS组在2h、6h、12h分别比较差异有统计学意义(P<0.05)；DEX和SB203580共同预处理后发挥协同作用，进一步抑制LPS诱导的IL-10增加，与DEX+LPS组在2h、6h、12h分别比较差异有统计学意义(P<0.05)，与SB+LPS组在2h、6h、12h分别比较差异也有统计学意义(P<0.05)；与LPS组比较，DEX+LPS组、SB+LPS组、DEX+SB+LPS组p-STAT3表达均显著减少(P<0.05)；与DEX+LPS组、SB+LPS组比较，DEX+SB+LPS组p-STAT3表达进一步减少(P<0.05)；与LPS组比较，DEX+LPS组、SB+LPS组、DEX+SB+LPS组p-STAT3表达均显著减少(P<0.