银屑病与正常角质形成细胞之间糖皮质激素受体的表达量无差异； 二、银屑病与正常角质形成细胞糖皮质激素受体核转运影响因素：1.银屑病患者与正常对照之间外周血促肾上腺皮质激素和皮质醇水平无差异; 2. VEGF165和IFN-γ可诱导正常角质形成细胞糖皮质激素受体核转运障碍； 3.地塞米松可逆转VEGF165和IFN-γ诱导的糖皮质激素受体核转运障碍； 4.内皮素-1、肝细胞生长因子、转化生长因子、白介素10、白介素13、白介素17、血小板源性生长因子(?)(?)A/AB/BB对正常角质形成细胞糖皮质激素受体核质转运无影响； 5.ATP水平对正常角质形成细胞糖皮质激素受体的核质转运无影响。 三、银屑病角质形成细胞糖皮质激素受体核质转运障碍机制： 1.p53抑制剂可抑制VEGF165和IFN-y诱导的糖皮质激素受体核质转运障碍； 2.微管抑制剂vincristine可抑制糖皮质激素受体的核摄取； 3.GSK-3抑制剂不能抑制糖皮质激素受体的核摄取； 4.地塞米松促进银屑病表皮角质形成细胞胞浆糖皮质激素受体进入细胞核内；

5. IL-13、PDGF-AA、PDGF-AB和PDGF-BB可促进银屑病表皮角质形成细胞糖皮质激素受体进入细胞核内,而ET-1、HGF、TGF-β1、IL-10和IL-17不能促进糖皮质激素受体进入细胞核内； 6.突然撤去地塞米松可诱导正常角质形成细胞糖皮质激素受体聚集在胞浆中。 四、IL-13和微管抑制剂对咪喹莫特诱导的小鼠银屑病模型的影响： 1.咪喹莫特诱导的Balb/c小鼠模型具有银屑病的主要特征,包括表皮过度增殖肥厚、炎症细胞浸润和真皮微血管增生； 2.IL-13可减轻咪喹莫特诱导小鼠的红斑、鳞屑、表皮厚度和浸润炎症细胞的数目； 3.微管抑制剂可加重咪喹莫特诱导小鼠的红斑、鳞屑和微血管数目。 【结论】 一、银屑病角质形成细胞糖皮质激素受体发生了核质转运障碍； 二、银屑病角质形成细胞糖皮质激素受体发生的核质转运障碍与体内促肾上腺皮质激素和皮质醇水平无关； 还有 三、VEGF165和IFRN-γ可诱导正常角质形成细胞糖皮质激素受体发生核质转运障碍,而地塞米松可逆转此诱导效应； 四、角质形成细胞糖皮质激素受体发生核质转运障碍是非APT依赖的； 五、VEGF165和IFN-γ诱导的糖皮质激素受体核质转运障碍需要p53参与； 六、微管介导糖皮质激素受体的核摄取,p53介导糖皮质激素受体的核输出,而GSK-3抑制剂不能抑制糖皮质激素受体的核转运； 七、地塞米松促进银屑病角质形成细胞糖皮质激素受体核转运需要微管参与；

八、IL-13、PDGF-AA、PDGF-AB和PDGF-BB可促进银屑病表皮角质形成细胞糖皮质激素受体进入细胞核内； 九、突然撤去地塞米松可诱导正常角质形成细胞糖皮质激素受体聚集于胞浆； 十、IL-13可减轻咪喹莫特诱导小鼠的银屑病样损害； 十一、微管抑制剂可加重咪喹莫特诱导小鼠的银屑病样损害。
第一部分GSK-3β在Jurkat细胞株及儿童急性淋巴细胞白血病骨髓单个核细胞中的定位与表达 目的 检测GSK-3β在人急性淋巴细胞白血病细胞株Jurkat与儿童急性淋巴细胞（ALL）白血病骨髓单个核细胞（BMMNC）中的定位与表达水平。 方法 实验分为实验组（Jurkat细胞及ALL细胞），对照组（骨髓象正常的ITP），采用Real

Time PCR技术、免疫荧光细胞化学染色及Westernblotting的方法，分别从mRNA和蛋白质水平进行检测。 R428 价格 结果 1.Real Time PCR结果显示，实验组与对照组均表达GSK-3βmRNA，Jurkat与ALL细胞中GSK-3β mRNA的表达水平分别为对照组的8.53和5.19倍，差异有统计学意义（P＜0.05）。 2.免疫荧光细胞化学染色及Western blotting结果均显示，实验组细胞中GSK-3β定位于细胞浆及胞核，呈高表达；对照组细胞中GSK-3β仅在细胞浆呈中等度表达，细胞核中不表达。 结论 GSK-3β在Jurkat细胞株与ALL患儿BMMNC细胞核中均呈异常 过度表达，提示GSK-3β发生了核转位，为GSK-3β调控细胞内信号分 子打下了理论基础。 第二部分抑制GSK-3β活性对急性淋巴细胞白血病细胞株Jurkat细胞凋亡的机制研究 实验一GSK-3β抑制剂诱导急性淋巴细胞白血病细胞株 Jurkat细胞凋亡的机制研究 目的 以Jurkat细胞作为实验细胞，采用GSK-3β抑制剂氯化锂（LiCl）和SB216763抑制GSK-3β，探讨抑制的GSK-3β介导的Wnt/β-catenin与NF-κB信号通路诱导细胞凋亡的分子机制。 时间 方法 分别应用LiCl和SB216763抑制GSK-3β，①MTT法检测Jurkat细胞增殖，并绘制细胞生长曲线；②Annexin V-PE/7-AAD双染法结合流式细胞仪检测细胞凋亡；③Western blotting方法检测Jurkat细胞中GSK-3β及其下游信号分子β-catenin和NF-κB P65定位与表达水平的变化；④RT-PCR检测Wnt/β-catenin与NF-κB信号通路下游靶基因survivin、c-myc和cyclinD1表达水平的变化。 结果 1.在LiCl浓度≥20mM，SB216763浓度≥15μM时，Jurkat细胞生长受到明显抑制，并呈浓度-时间依赖性。 2.以NaCl作为对照，LiCl在20、30、40mM浓度下的凋亡率分别为（10.89±1.32）%、（23.74±1.65）%、（38.26±4.37）%；以DMSO作为对照，SB216763各浓度组的细胞凋亡率分别为（14.71±2.53）%、（24.92±4.58）%、（43.25±4.72）%，实验组的细胞凋亡与对照组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。 3.LiCl（20mM）抑制GSK-3β活性后，与对照组相比，β-catenin蛋白在胞浆和胞核中的表达分别增加了约2.15和1.63倍，差异有统计学意义（P＜0.05）；NF-κB P65蛋白在胞浆和胞核中的表达均无明显变化。SB216763(15μM)抑制GSK-3β活性后，与对照组相比，β-catenin蛋白在胞浆和胞核中的表达分别增加了约3.27和2.84倍，差异有统计学意义（P＜0.05）；NF-κB P65蛋白在胞浆和胞核中的表达也均无明显变化。 4.

PKI-587是一种高效的双向PI3Kα, PI3Kγ和mTOR的抑制剂,其在包括乳腺癌、肺癌、黑色素瘤、肠癌及肝癌在内的多种肿瘤细胞株中都有强烈的抑制生长作用。由于在体外及移植瘤模型中PKI-587都发挥了强效的抗肿瘤作用,因此,为了更好的评估它的抗肿瘤活性,更多的Ⅰ期临床试验(NCT00940498)正在开展中。 在本研究中,我们在体内外水平来研究双向PI3K/mTOR抑制剂的抗肿瘤活性及对辐射敏感性的影响。为了更好的观察双向PI3K/mTOR抑制剂的效果及证实结果的可靠性,我们同时研究了两种双向PI3K/mTOR抑制剂：GSK2126458和PKI-587。我们认为联合双向PI3K/mTOR抑制剂和辐射可以增强鼻咽癌患者的临床疗效,并为今后鼻咽癌的靶向治疗的发展提供理论基础。

selleck化学 方法： 1.细胞增殖实验 细胞增殖实验检测双向PI3K/mTOR抑制剂对鼻咽癌增殖的影响。将对数生长期的鼻咽癌细胞以每孔2×103个/100ul接种于96孔板中,贴壁24小时后在每孔中加入不同浓度的GSK2126458或PKI-587或培养基,继续培养72小时。然后,加入50ul的MTT溶液,在37℃的孵箱中培育2小时,移去MTT液,加入100ul的DMSO,在酶标仪下分别检测550nm和630nm处的吸光度。生长分数是以对照组为基准来计算的。每个实验重复至少三次,每次至少3个复孔。 不 2. Western blot实验 Western blot实验检测双向PI3K/mTOR抑制剂对PI3K/Akt/mTOR通路蛋白的影响。用含有蛋白酶抑制剂和磷酸化酶抑制剂的细胞裂解液来裂解鼻咽癌细胞,并用BCA试剂盒检测蛋白浓度。将约40ug的总蛋白通过SDS-PAGE凝胶分离后转移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)上,清洗4遍后,用5%小牛血白蛋白(BSA)在室温下封闭一小时后,加入一抗4℃孵育过夜。再清洗3遍后,加入特异性二抗,在室温下孵育1小时。最后用化学发光试剂盒检测蛋白条带。每个实验至少重复3次。

3.划痕实验 划痕实验检测双向PI3K/mTOR抑制剂对细胞迁移的影响。将细胞以80%-90%的密度种入6孔板中,贴壁24小时后,用0.2ml的枪头在汇合的单层细胞上轻轻滑过,用PBS洗干净划下的悬浮细胞后,加入含有双向PI3K/mTOR抑制剂的无血清培养基或单纯无血清培养基(对照组)培养24小时,并在不同的时间点(0h,12h,24h)拍照,测量划痕宽度。每组3个复孔,每孔随机选取9个含划痕的视野拍照测量,每个实验重复3次。 4.细胞迁移和侵袭实验 细胞迁移和侵袭实验检测双向PI3K/mTOR抑制剂对细胞迁移和侵袭的影响。我们采用transwell小室来检测细胞的迁移和侵袭。Transwell小室的顶部和底部通过含有胶原质的8um的滤过膜分开。在迁移实验中,直接将培养基中含有0.1%BSA的1×105个肿瘤细胞种入小室内,而侵袭实验则需要加铺20-50μg/cm2的BD公司的基质胶在小室内,再种细胞,将含有GSK2126548或PKI-587的培养基加入小室下方。在37℃的孵箱中孵育24小时后,用棉签擦去留在残留在小室内没有迁移或侵袭的细胞。迁移和侵袭到小室下方的细胞则用甲醇固定、结晶紫染色。在200倍显微镜下随机取5个视野计数迁移和侵袭的细胞,每个实验重复3次。 5.克隆形成实验 克隆形成实验检测双向PI3K/mTOR抑制剂对鼻咽癌细胞辐射敏感性的影响。4种鼻咽癌细胞株按照不同浓度种入60mm的小皿中。在照射不同剂量射线(0,2,4,6,8Gy)前1小时加入GSK2126548或PKI-587,药物维持24小时后更换培养基。培养约14天后,细胞用甲醇固定,并用0.5%的结晶紫染色。计数含50个细胞以上的克隆数,计算克隆形成率及存活分数。每个实验进行3次,每次3个复孔。运用GraphPad

Prism5.0软件进行多靶单击曲线拟合,并绘制存活曲线。采用的多靶单击模型的公式为：SF=1-(1-e-D/D0)N。 6.免疫荧光实验 免疫荧光实验用来检测双向PI3K/mTOR抑制剂联合放疗对双链DNA损伤的影响。我们用γ-H2AX抗体来检测DNA双链的断裂损伤。首先,将一定浓度的细胞种在玻片上37℃孵育24小时,然后加入GSK2126548(0.003μM)或PKI-587(0.03μM)孵育1小时后,进行4Gy射线照射,照射后24小时计数细胞内焦点数目。照完射线后24小时先用4%的多聚甲醛固定细胞,再用抗γ-H2AX的一抗4℃孵育过夜,洗掉一抗后,加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的二抗。在荧光显微镜下观察DNA损伤。每组5个复孔,每孔至少计数50个细胞,每个实验重复3次。 CAL-101 价格 7.细胞周期实验和细胞凋亡实验 细胞周期及凋亡实验用来检测双向PI3K/mTOR抑制剂联合放疗对细胞周期和凋亡的影响。将对数生长期的细胞种入6孔板中,加入GSK2126548或PKI-5871小时后,接受4Gy射线照射,照射后24小时收集细胞,用含有2%胎牛血清的冰PBS洗涤2遍后,加入70%的冰乙醇中-20℃过夜,沉淀、冲洗细胞后,在室温下加入PI染色液染色30分钟。凋亡实验则参照BD公司的annexin V-FITC凋亡试剂盒说明书进行。使用FACS流式细胞仪的CellQuest软件进行数据分析,所有的实验重复至少3次。 8.

25、12.5、25、50μmol/L PD98059中体外孵育,用0.1%伊红染色后在倒致显微镜下观察原头节形态并检测活力,试验重复3次;于透射电子显微镜(TEM)下观察PD98059作用后原头节超微结构变化;采用Caspase-3活性检测试剂盒检测原头节caspase-3酶活性。结果 DMEM/DMEM+DMSO培养组原头节活力较开始时无明显变化。50μmol/L PD98059作用48h后,原头节活力下降为(55.16±0.212)%,作用第14d,无存活的原头节。低浓度组对原头节的杀伤作用较高浓度组弱。TEM观察PD98059处理后的原头节微毛及糖萼出现部分缺损,合胞体带内出现少量小的空泡,且随用药浓度的增大,空泡增大增多并出现脂滴。ELISA检测显示,经PD98059处理的原头节caspase-3酶活性较正常对照组增强。结论 ERK抑制剂PD98059在体外有抗泡状棘球蚴作用。
Rac亚家族由Rac1、Rac2、Rac3及Rac1b(Rac1的剪切突变体)组成,Rac1广泛分布于各种组织,Rac2局限分布于血液细胞,Rac3则主要表达于神经元。Rac1是细胞内一类重要的信号转导分子,与恶性肿瘤发生、发展关系密切。1

www.selleckchem.cn/products/BI-2536.html Rac1的结构与功能人类Rac1基因定位于第7号染色体p22,全长29kb,共包含7个外显子,其转录产物有两种,一种为2.5kb大小,另一种为1.2kb大小。Rac1的基本生物学功能是结合并水解鸟苷酸,具有两种结合状态,一种是结合GTP的激活状态,另一种是结合GDP的
目的卵巢器官胰岛素通路障碍与生殖机能异常密切相关,文中旨在探讨胰岛素抵抗对卵巢生殖功能的影响,并评估隐丹参酮对卵巢器官胰岛素抵抗的治疗作用。方法将30只小鼠随机分为等渗盐水组、地塞米松a组(等渗盐水+地塞米松)和隐丹参酮a组(等渗盐水+地塞米松+隐丹参酮),每组10只。对各组小鼠进行胰岛素抵抗程度检测,测量每分钟衰变数(disintegrations

MK-2206研究购买 per minute,DPM)、排卵率及血清激素水平检测。并将20只雌性小鼠处死后所得卵巢随机分为4组,每组8只卵巢:空白对照组(空白培养液)、地塞米松b组(地塞米松)、隐丹参酮b组(地塞米松+隐丹参酮)、沃曼青霉素组(地塞米松+隐丹参酮+沃曼青霉素),进行小鼠卵巢器官的体外培养,检测卵巢葡萄糖摄取量及培养液激素水平。结果1小鼠卵巢发生胰岛素抵抗后,地塞米松a组与等渗盐水组肝、脂肪、卵巢组织氚标记葡萄糖含量比较,差异均有统计学意义(P<0.01];2与地塞米松a组排卵数、平均黄体数[(37.5±7.0)个、(5.0±1.8)个)]比较,等渗盐水组[(26.3±5.9)个、(3.5±1.6)个]和隐丹参酮组[(27.2±6.3)个、(3.8±0.9)个]均降低(P<0.05)。3等渗盐水组和隐丹参酮a组雌二醇、孕酮水平较地塞米松a组均显著降低(P<0.05)。4地塞米松a组P-AKT2蛋白分子表达量较等渗盐水组显著降低[(0.39±0.01)vs(0.77±0.03),P<0.01)。6与空白对照组比较,地塞米松b组培养液睾酮显著上升,孕酮水平显著下降,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论中药隐丹参酮在体内及体外都能够缓解小鼠卵巢胰岛素抵抗程度,中药隐丹参酮可能通过PI3K途径发挥胰岛素增敏作用。
为研究身痛逐瘀汤对LPS诱导的巨噬细胞一氧化氮(NO)分泌的抑制作用及其机制。结果表明:身痛逐瘀汤选择性地抑制P38

selleck合成 MAPK信号通路,从而发挥明显抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞一氧化氮的分泌、一氧化氮合成酶(i NOS)蛋白质表达以及巨噬细胞内活性氧(ROS)水平的作用。
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种神经退行性疾病,临床表现为认知功能障碍,病理学研究发现脑萎缩,细胞外老年斑(senile plaque,SP)沉积及细胞内出现神经纤维缠结(neurofibrillary tangle,NFT)。AD发病机制尚不清楚,因此动物模型的建立对探索其发病机制具有重要意义。该文就AD实验动物模型研究进展作一综述,详细描述并评价了目前常见的AD模型及其在药物研发中的应用。
目的探讨参芎化瘀胶囊对脑缺血-再灌注损伤的保护作用及机制。方法通过改良的Pulsineli 4血管阻断(4-VO)法制作全脑缺血-再灌注大鼠模型。72只雄性SD大鼠随机分成假手术组、模型组、参芎化瘀胶囊组。术后首先应用尼氏体和TUNEL染色研究缺血-再灌注后大鼠海马区神经元的形态学变化和凋亡情况,然后以免疫组织化学法检测海马区p38MARK的表达。结果假手术组相比,模型组可见大量的凋亡细胞,p38MARK蛋白表达增多,参芎化瘀胶囊组的凋亡细胞数量较模型组明显减少(p<0.05),p38MARK蛋白表达水平较低(p<0.

05) 结论 1、FSK、RA、HRG、PDGF-AA、bFGF诱导剂能诱导新生大鼠海马神经干细胞分化为施万样细胞。 2、神经干细胞源性施万样细胞表达胶质细胞标志性蛋白：S-100和P75,表达P0、Krox-20、Oct-6等施万细胞标志性mRNA;分泌促进神经元轴突生长的可溶性营养因子。 3、神经干细胞分化为施万样细胞过程中磷酸化ERK表达增强,ERK信号转导通路被激活。 4、在神经干细胞分化为施万样细胞过程中,加入ERK信号转导通路抑制剂U0126,能够抑制神经干细胞分化为施万样细胞。P38、JNK信号转导通路抑制剂SB203580和SP600125对神经干细胞分化为施万样细胞无明显作用。
目的：文献提示活化小胶质细胞介导的炎症反应在脊髓创伤继发性损伤中起重要作用；EGFR通路和小胶质细胞的活化有一定的相关性。本研究旨在探讨EGFR通路的激活与小胶质细胞活化相关炎症的关系,EGFR抑制剂对小胶质细胞活化相关炎症的影响,以及EGFR抑制剂对脊髓继发性损伤和损伤后修复的影响。

点击此处 方法：LPS刺激模拟小胶质细胞的炎症活化,自由落体打击法建立脊髓创伤大鼠模型。C225或AG1478干预活化细胞或损伤动物。逆转录PCR和ELISA检测小胶质细胞的IL-1β和TNFα的合成和分泌；免疫荧光法观察小胶质细胞形态变化,pEGFR的表达,脊髓损伤后胶质细胞的活化以及血管的改变；Western Blot检钡EGFR、pEGFR、MAPKs、IL-1β和TNFa的表达；钙成像技术和钙抑制实验检测钙活动在LPS诱导的EGFR磷酸化中的作用；干湿重法评价水肿程度；轴突示踪检测轴突修复；BBB评分和CBS评分评估神经功能的恢复。 结果：1)LPS诱导小胶质细胞出现活化形态,pEGFR表达增高,以及IL-1p和TNFa的mRNA表达和培养上清液中蛋白含量的显著增高；与LPS刺激组相比,这些变化在C225干预组和AG1478干预组被明显抑制。2)LPS刺激可迅速引起小胶质细胞内的钙活动；EGFR的磷酸化可以被BAPTA/AM或KN62抑制,但是不能被EGTA抑制。3)LPS诱导BV2细胞Erkl/2、JNK和p38的磷酸化增加,以及IL-1β和TNFα的表达升高；此现象可以被C225和AG1478缓解。U0126,SP600125和SB203580不同程度抑制了LPS诱导的小胶质细胞的IL-1p和TNFa表达。4)在脊髓损伤后,pEGFR的表达显著增高,并定位于活化的小胶质细胞。5)C225和AG1478抑制脊髓损伤区pEGFR、Erk1/2和p38MAPK的表达,减少IL-1β和TNFα的表达,减轻组织含水量,减轻胶质细胞活化,并缓解脊髓损伤灶附近血管的扩张和高通透性改变；干预同时减轻了胶质疤痕的形成和坏死灶的面积,并伴有轴突恢复和损伤14d、28d时神经功能的改善。

许多 结论：EGFR抑制剂通过抑制MAPK通路缓解了LPS对小胶质细胞的活化作用；并缓解脊髓损伤后的急性期炎症改变,从而减轻继发性损伤,促进轴突修复和脊髓损伤大鼠的神经功能恢复。EGFR通路可以成为脊髓损伤治疗的靶点；C225和AG1478有望在脊髓损伤治疗中发挥积极作用。
背景: 糖尿病能够引起机体多种组织器官损伤甚至功能衰竭。随着人们生活水平的提高,肥胖人群逐年增加,2型糖尿病的发病率逐年上升,其并发症糖尿病心肌病(DCM)日益受到重视。高脂能够诱导心肌细胞发生凋亡,而心肌细胞凋亡在DCM的发病机制中占有重要地位,然而,有关高脂诱导心肌细胞凋亡的具体机制目前尚未彻底阐明。

有关基质细胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1,SDF-1)的很多研究证明,SDF-1参与调节许多重要的生物过程,包括心脏和神经元发育、干细胞动员、血管新生、肿瘤发生及转移等。SDF-1调节这些迥异的生物进程是通过其经典的细胞表面特异性趋化因子受体4(CXCR4)实现的。但近年来研究发现,CXCR4并不是SDF-1在细胞表面的唯一受体,除CXCR4外还存在CXCR7,但CXCR7并不能广泛表达,其与CXCR4相比具有不同的生物学功能。 关于SDF-1对心脏系统的影响,既往研究主要集中于其动员干细胞至心脏损伤的部位,并通过血管新生修复心脏损伤,但SDF-1对脂毒性所致的心脏细胞损伤是否具有直接保护作用目前尚未有相关报道。 Selleck Sorafenib 目的: 本研究在体外用饱和脂肪酸棕榈酸酯(palmitate,Pal)模拟2型糖尿病时机体内的高脂环境,来处理大鼠胚胎心肌细胞(H9c2),一方面拟阐明脂毒性诱导心肌细胞发生凋亡的机制;另一方面,探讨SDF-1β对高脂诱导的H9c2细胞凋亡是否具有保护作用,若具有保护作用,拟揭示其分子机制。 方法: 1. Pal诱导H9c2细胞凋亡及机制研究 (1)首先用Pal处理H9c2细胞,做剂量效应及时间效应实验,分别用western-blot检测cleaved-caspase3和细胞死亡ELISA试剂盒检测DNA链断裂来观察Pal诱导细胞的凋亡效应,从而选择出Pal诱导H9c2细胞凋亡的最适剂量及最佳处理时间。 (2)用western-blot的方法检测Pal诱导细胞凋亡不同信号通路上的关键蛋白(p-p53、p53、Bax、Bcl-2、AIF、GRP78、caspase12、CHOP and caspase8)进而确定Pal诱导H9c2心肌细胞凋亡的具体途径。 (3)用western-blot的方法检测3-NT,观察Pal能否引起H9c2细胞的硝化损伤。 (4)用western-blot的方法检测不同的阻滞剂或清除剂(apocynin、MnTMPyP、L-NAME、urate、4-PBA)对Pal诱导细胞硝化损伤、内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)及凋亡的影响,并明确硝化损伤、ERS及凋亡这三种现象之间是否有内在联系。 2.

心脏特异性敲除pdk1小鼠的鉴定与电生理改变的初步探索目的:心脏特异性敲除pdk1小鼠模型的鉴定。方法:采用westernblot方法,检测小鼠心室肌细胞pdk1的表达情况;运用体表心电图检测基因敲除后小鼠心率、qrs、qtc的变化。结果:基因敲除后的8周,心室肌pdk1的表达显著下降。且心电图表现为心率下降(362.22±12.69vs.422.31±20.10,p
肺癌已经成为癌症相关病死率最高的恶性肿瘤,2012年赫捷院士报道了中国排名前十位的肿瘤发病率和死亡率,肺癌无论从发病率还是死亡率来讲,都是名列第一位,其中80%以上病例为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC),确诊为NSCLC时,尽管近来年采用了多种综合预防和治疗手段,仍然难以显著降低其发病率和改善其生存率,肺癌的5年生存率约为15%,因此,系统的研究NSCLC的发生、发展机制,筛选有效的治疗靶点和治疗药物,一直是肿瘤研究中面临的巨大挑战。作为抑癌基因p53的负性调控因子,p53诱导的蛋白磷酸酶1(Wild-type p53-induced phosphatase

1,Wip1)位于人染色体17q23/q24区域,属于丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶PP2C(PP2C 无 type protein phosphatase)家族成员,由PPM1D编码,人的Wip1蛋白分子量约为61k D,由605个氨基酸组成,能够通过依赖于p53蛋白途径和非依赖于p53蛋白途径,促进肿瘤进展。近年来,肺癌、乳腺癌、胰腺癌、膀胱、肝、脑膜、和神经母细胞瘤细胞系中发现了Wip1的扩增。此外,许多人类原发性肿瘤(如神经母细胞瘤、卵巢透明细胞腺癌、乳腺癌、胰腺腺癌)包含扩增的Wip1基因和高表达的Wip1蛋白质,并且显示出与癌症患者预后不佳有关。Naoyuki Satoh等发现原发性肺腺癌患者,Wip1在肿瘤上皮细胞表达的增加,与肿瘤进展和临床预后具有重要意义。因此本研究拟观察Wip1在NSCLC中表达的临床病理意义和其判断预后的价值,并分析Wip1具体作用机制,为将其作为一个NSCLC候选治疗靶点提供进一步的理论和实验依据。第一部分p53诱导的蛋白磷酸酶1(Wip1)在非小细胞肺癌中表达的临床病理意义及其预后价值分析目的:研究Wip1在非小细胞肺癌中表达的临床病理意义,并分析其预后价值。方法:收集河北省胸科医院2001年-2010年期间117例NSCLC患者临床样本,均具有完整的随访资料,10例来自于支气管扩张等手术中切除的正常肺组织及癌旁肺组织作为对照组。采用免疫组织化学方法,检测Wip1在正常肺组织和非小细胞肺癌组织中的表达。采用SPSS

13.0统计软件进行数据分析,应用Pearsonχ2检验和t检验分析其表达的临床病理意义。使用Kaplan-Meier法绘制生存曲线并计算生存率,单因素分析应用Log rank检验进行相关性判断,多因素分析使用Cox比例风险模型,采用逐步回归分析进行危险因素判断。以α=0.05为检验水平,以P3 cm病例占85.2%(69/81),Wip1蛋白阴性表达组中,肿瘤大小≤3 cm占38.9%(14/36),肿瘤体积>3 cm病例占61.1%(22/36),采用χ2检验进行统计,发现非小细胞肺癌组织中Wip1蛋白表达与肿瘤大小相关,差异有统计学意义(χ2=8.357,P=0.004)。Wip1蛋白阳性表达组中,淋巴结无转移病例占55.6%(45/81),淋巴结转移病例占44.4%(36/81),Wip1蛋白阴性表达组中,淋巴结无转移病例占69.4%(25/36),淋巴结转移病例占30.6%(11/36),采用χ2检验进行统计,发现非小细胞肺癌组织中Wip1蛋白表达与淋巴结转移不相关,差异无统计学意义(χ2=2.000,P=0.157)。非小细胞肺癌Wip1蛋白阳性表达组织中,临床分期I-II期占55.6%(45/81),III-IV期占44.4%(36/81),Wip1蛋白阴性表达组中,临床分期I-II期占75.0%(27/36),III-IV期占25.0%(9/36),采用χ2检验进行统计,发现非小细胞肺癌组织中Wip1蛋白表达与临床分期相关,差异有统计学意义(χ2=3.98,P=0.046)。3单因素Log-rank检验分析显示Wip1表达与患者预后差相关,Wip1阳性表达组总体生存率低于Wip1阴性表达组。Cox回归模型分析显示高Wip1表达相对危险度为5.096(95%可信区间=1.501-17.303),临床分期相对危险度为0.159(95%可信区间=0.037-0.680),均具有统计学差异。小结:1

Selleckchem Ivacaftor Wip1在NSCLC组织中高表达。2 Wip1表达水平与非小细胞肺癌病理分型、肿瘤大小、临床分期关系密切,而与患者的年龄、性别、组织分化程度、淋巴结转移无关。3 有 Wip1阳性表达组总体生存期低于Wip1阴性表达组,其高表达是预后不良的高风险因子。第二部分Wip1-si RNA对非小细胞肺癌细胞增殖的影响目的:研究基因沉默Wip1对NSCLC A549细胞、NCI-H1299细胞增殖的抑制作用及其调节机制。方法:研究采用RNA干扰技术基因沉默Wip1。采用real-time PCR技术和Western blot技术从三个设计的si RNA中筛选出最有效的si RNA。通过MTT技术观察细胞增殖情况,流式细胞术观察细胞周期,并应用Western blot检测细胞内增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、P21及P27的表达。结果:1三种Wip1-si RNA(40 n M)转染A549细胞、NCI-H1299细胞株48h,对Wip1的表达均具有一定的沉默作用,其中Wip1-si RNA-3的沉默效率最高,达到90%以上;而空白对照组及阴性转染组Wip1 m RNA及蛋白表达水平无明显变化。2与阴性转染组细胞相比,基因沉默Wip1对非小细胞肺癌细胞A549、NCI-H1299的细胞增殖具有显著的抑制作用,明显高于Wip1-si RNA转染组,差异具有统计学意义(P0.

These results thus demonstrate that opioids prime neurons to undergo apoptosis by inducing TLR2 expression. Our data suggest that inhibition of TLR2 is capable of preventing opioids-induced damage to neurons. Opioids are powerful pain relievers, but also potent inducers of dependence and tolerance. Chronic morphine administration (via subcutaneous

pellet) induces morphine dependence in the nucleus accumbens, a key dependence region in the brain, yet the cellular mechanisms are mostly unknown. Toll-like receptor 2 (TLR2) plays an essential function in controlling innate and inflammatory responses. Using a knockout mouse lacking TLR2, we assessed the contribution of TLR2 to the development of morphine dependence and microglia activation. We report here that mice deficient in TLR2 inhibit morphine-induced Dinaciclib体外 the levels of microglia Saracatinib研究购买 activation and proinflammatory cytokines. Moreover, in TLR2 knockout mice the main symptoms of morphine withdrawal were significantly attenuated. Our data demonstrate that TLR2 is critical for opioid dependence and is a factor in response to innate immune response. As resveratrol derivatives, resveratrol

aliphatic acids were synthesized in our laboratory. Previously, we reported the improved pharmaceutical properties of the compounds compared to resveratrol, including better solubility in water and much tighter binding with human serum albumin. Here, we investigate the role of resveratrol aliphatic acids in Toll-like receptor 2 (TLR2)-mediated apoptosis. We showed that resveratrol aliphatic acid (R6A) significantly inhibits the expression of TLR2. In addition, overexpression of TLR2 in HEK293 cells caused a significant decrease in apoptosis after R6A treatment. Moreover, inhibition of TLR2

by R6A decreases serum deprivation-reduced the levels of phosphorylated Akt and phosphorylated glycogen synthase kinase 3(3 (GSK3β). Our study thus demonstrates that the resveratrol aliphatic acid inhibits cell apoptosis through TLR2 by the involvement of Akt/GSK3βpathway. TLR4 (Toll-like receptor-4), a key member of the TLRs family, has been well characterized by its function in induction of 不 inflammatory products of innate immunity. However, the involvement of TLR4 in a variety of apoptotic events with an unknown mechanism recently interests great research focus. Our investigation found that TLR4 promoted apoptotic signaling through affecting glycogen synthase kinase-3β(GSK-3(3) pathway in the serum deprivation (SD)-induced apoptotic paradigm. SD induces GSK-3βactivation in a pathway that leads to subsequent cell apoptosis. Intriguingly, this apoptotic cascade is amplified in presence of TLR4 whereas greatly attenuated byβ-arrestin 2, another critical molecule implicated in TLR4 mediated immune responses.

05),增加大鼠穿越平台次数(P<0.05),抑制大鼠缺血脑组织p38蛋白的表达(P<0.05)。结论山楂叶总黄酮对慢性脑缺血大鼠的神经功能具有保护作用,其机制可能与抑制p38蛋白表达,减轻脑神经元凋亡有关。
血管钙化是诸如高血压、动脉粥样硬化、糖尿病及慢性肾功能衰竭等疾病的共同病理生理基础和重要危险因素之一,其发病机制尚不明确。近年来,心血管系统分泌的内源性生物活性肽在血管钙化的发生发展中发挥的作用受到越来越多的重视。然而,内源性活性多肽及其受体在血管钙化中一般作用规律和个体化调控特征尚需进一步探讨。因此,本文综述内源性生物活性肽,如皮质抑素、血管紧张素1-7、Aplin和瘦素等,在血管钙化中的作用及新进展,有助于揭示血管钙化的发病机制,从而为血管钙化的防治提供更多理论支持和思路。
目的:探讨氧化苦参碱对人子宫内膜癌细胞HEC-1-B增殖、侵袭转移的作用及其机制。方法:MTT法检测细胞增殖抑制率;Transwell小室法观察细胞侵袭转移的改变;Western

blot及Real-time PCR法检测p38、p-p38、MMP-2和MMP-9表达水平的变化。结果:一定浓度氧化苦参碱可显著抑制子宫内膜癌细胞HEC-1-B的增殖、侵袭转移,并呈时间和剂量依赖性。氧化苦参碱可显著降低HEC-1-B细胞中p38及MMPs的表达水平。联合应用SB203580能够有效增强氧化苦参碱的抗肿瘤细胞侵袭转移能力。结论:氧化苦参碱可以抑制子宫内膜癌细胞的增殖、侵袭转移,并下调p38磷酸化以及MMP2、MMP9的表达。
目的:探讨运动预处理后内源性阿片肽(EOP)对大鼠心肌缺血再灌注损伤延迟性保护作用及机制。方法:健康雄性SD大鼠75只,随机分成假手术组(sham组)、缺血再灌注模型组(I/R组)、运动预处理组(EP组)、运动预处理+纳洛酮(naloxine)组(EPN组)、运动预处理+白屈菜赤碱(chelerythrine)组(EPC)。在运动预适应模型基础上,结扎左冠状动脉前降支复制大鼠心肌缺血再灌注模型,采用多道生理记录仪描记血流动力学参数,用酶联免疫法(ELASA)检测血清心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)和心肌环氧化酶-2(COX-2),用化学比色法检测心肌诱导型一氧化氮合酶(i 这个 NOS)活性,用黄嘌呤氧化法检测心肌锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)活性,用原子分光光度法检测心肌中钙离子(Ca2+)浓度。结果:1与I/R组相比,EP组在再灌注期左室收缩压(LVSP)、左室内压最大上升速率(+dp/dt

max)降低幅度明显减小(P<0.05);与EP组相比,EPN组和EPC组中血清cTnⅠ值明显升高,有显著性意义(P<0.05),EPN组心肌COX-2显著降低(P<0.05),EPN组和EPC组心肌细胞胞浆中Ca2+浓度有降低趋势,但差异不显著;与EP组相比,EPN组和EPC组中心肌细胞胞浆中Ca2+浓度明显升高,有显著性意义(P<0.05)。结论:运动预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤有保护作用,内源性阿片肽可能通过蛋白激酶C(PKC)及下游信号途径减轻心肌细胞钙超载和改善微循环,发挥延迟性保护效应。
急性胰腺炎是临床常见急症重症之一,关于急性胰腺炎的病理生理学研究进展表明,这一炎症反应,伴随着局部和全身系统性的促炎和抗炎介质的释放。同时炎性因子抑制剂的应用对急性胰腺炎有较好的临床疗效,为急性胰腺炎的治疗提供了新的广阔的前景。
Tetrandrine(Tet), selleck产品 the main active constituent of Stephania tetrandra root, has been demonstrated to alleviate adjuvant-induced 有 arthritis in rats. The present study was designed to investigate the effects of Tet on the migration and invasion of rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes(RA-FLS) and explore the underlying mechanisms. By using cultures of primary

FLS isolated from synoviums of RA patients and cell line MH7 A, Tet(0.3, 1 μmol·L-1) was proven to significantly impede migration and invasion of RA-FLS, but not cell proliferation. Tet also greatly reduced the activation and expressions of matrix degrading enzymes MMP-2/9, the expression of F-actin and the activation of FAK, which controlled the morphologic changes in migration process of FLS. To identify the key signaling pathways by which Tet exerts anti-migration effect, the specific inhibitors of multiple signaling pathways LY294002, Triciribine, SP600125, U0126, SB203580, and PDTC(against PI3 K, Akt, JNK, ERK, p38 MAPK and NF-κB-p65, respectively) were used. Among them, LY294002, Triciribine, and SP600125 were shown to obviously inhibit the migration of MH7 A cells. Consistently, Tet was able to down-regulate the activation of Akt and JNK as demonstrated by Western blotting assay.

05）。加入茶多酚干预后，LOX-1mRNA表达均下降，但正常对照组加茶多酚与干预前差异无统计学意义，高糖组加入茶多酚后，差异有统计学意义（P＜0.05）。 4与正常对照组相比，高糖组p38MAPK蛋白浓度增加，差异有统计学意义，加入茶多酚后，其表达量下降，差异有统计学意义。分别与正常对照组及高糖组相比较，加入p38MAPK抑制剂SB203580后，sFlt-1mRNA、蛋白及LOX-1mRNA几乎无表达。 结论： 1高糖环境可以引起脐静脉内皮细胞sFlt-1的表达活性降低，LOX-1含量增加，两者可能在糖尿病血管病变的进程中发挥重要作用。 2茶多酚可以明显降低高糖诱导的脐静脉内皮细胞LOX-1的高表达并上调sFlt-1的表达，减轻高糖对脐静脉内皮细胞的损伤作用，减少动脉硬化的发生及新生血管的形成。 3p38MAPK在高糖环境下可被激活，其抑制剂可明显抑制LOX-1及sFlt-1的表达量，表明高糖诱导的HUVEC的LOX-1及sFlt-1的表达变化可能通过p38MAPK通路。
目的：目前，缺血性脑病的发病率在全球不断上升，形势也日益严峻。多年来，许多研究人员致力于研究脑缺血耐受机体的内源性保护机制，以期提高神经细胞对缺血性损害的抵抗力，使其在遭受较严重的缺血打击后仍保持存活，并在恢复供血后仍具有正常的生理功能。

我室既往研究证实，反复3次股动脉夹闭和再灌的肢体缺血预处理（limb ischemic preconditioning，LIP）可减轻随后即刻发生的脑缺血再灌注引起的大鼠海马CA1区锥体神经元延迟性死亡和凋亡、诱导脑缺血耐受，证实了远隔器官缺血预处理对脑的保护作用。虽然脑缺血的发生无法预测，但是在心肺分流术等一些发生脑缺血危险几率较高的手术中，全脑缺血性损伤是可以预知的。如果能在损伤发生之前就施予干预措施，无疑具有重要的现实意义。因此，探讨LIP脑保护作用的机制可为开发神经保护药物或方法提供新的思路。 MAPK是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在哺乳类细胞目前已发现存在着下述三条并行的MAPKs信号通路：ERK、JNK和p38MAPK通路。我室既往采用免疫组织化学、硫堇染色以及Western

Depsipeptide Z-VAD-FMK 花费 blot等方法研究证实，p38MAPK参与了LIP诱导的大鼠脑缺血耐受，并且在这一过程中上调了HSP70的表达、抑制了凋亡通路、改变了超氧化物歧化酶的活性。但是，p38MAPK的神经保护机制尚不完全清楚。 谷氨酸是中枢神经系统最主要的兴奋性神经递质，但过高浓度的谷氨酸又具有极强的神经毒性。脑缺血时，细胞外液中谷氨酸等兴奋性氨基酸浓度异常升高，通过钙超载、干扰能量代谢等导致细胞损伤。细胞外谷氨酸清除的主要途径是兴奋性氨基酸转运体（excitatory amino transporters,EAATs）摄取谷氨酸。目前已发现五种高亲和力谷氨酸转运体：GLAST（EAAT1）、GLT-1（EAAT2）、EAAC1（EAAT3）、EAAT4和EAAT5。研究证实，GLT-1在防止其兴奋性毒性作用方面发挥着更为重要的作用。因此，对GLT-1进行调制，增强其对细胞外液中谷氨酸的摄取以及防止其出现逆向转运，是防止脑缺血时细胞外液中谷氨酸浓度异常升高及其神经毒性作用的有效方法。我室研究发现，脑缺血预处理可抑制全脑缺血打击引起的海马CA1区锥体神经元的延迟性死亡，同时可上调海马CA1区GLT-1的表达，抑制脑缺血引起的细胞外液中谷氨酸浓度的升高；而应用GLT-1特异性抑制剂DHK或GLT-1反义寡聚脱氧核苷酸后，均能剂量依赖性的阻断脑缺血预处理对全脑缺血大鼠的神经保护作用，提示GLT-1参与了脑缺血预处理诱导的脑缺血耐受。 那么，LIP诱导的脑缺血耐受是否有GLT-1的参与呢？如果有，GLT-1与我们先前研究的p38MAPK之间是否有级联关系？实际上，既往文献中有关p38MAPK对GLT-1调制作用的研究已有报道。2009年，Tsai等在百日咳毒素致热痛觉过敏大鼠模型中发现，p38MAPK特异性抑制剂SB203580能减轻此种痛敏反应、增加脑脊液中兴奋性氨基酸、下调谷氨酸转运体的表达。此外，Matos等在阿耳茨海默氏病的研究中证实，SB203580能够下调星形胶质细胞中GLT-1的表达。我室在近期的工作中，也证实了p38MAPK通过调制GLT-1在脑缺血预处理诱导的脑缺血耐受中发挥了重要作用。 因此，本研究的目的在于：①观察LIP不同时间窗对脑缺血再灌注损伤的影响，并应用GLT-1特异性抑制剂DHK，观察抑制GLT-1表达对LIP诱导的脑缺血耐受的影响；②观察并比较LIP后大鼠海马CA1区p38MAPK和GLT-1表达的时间过程；③应用p38MAPK抑制剂SB203580，观察抑制p38MAPK后，大鼠海马CA1区GLT-1表达的变化。通过上述研究，探讨p38MAPK是否通过调制GLT-1参与肢体缺血预处理诱导的脑缺血耐受，为脑缺血性疾病的防治提供新的思路。

1LIP减轻大鼠全脑缺血再灌注引起的海马CA1区迟发性神经元死亡及GLT-1在此过程中的作用 1.1观察LIP不同时间窗对脑缺血再灌注损伤的影响 50只Wistar大鼠永久凝闭双侧椎动脉恢复两天后，随机分为四组：①全脑缺血的sham组（n=5）：暴露双侧颈总动脉8min，但不阻断血流；②全脑缺血组（n=5）：夹闭双侧颈总动脉8min后恢复再灌注；③LIP+全脑缺血组（n=35）：夹闭双侧股动脉10min、再灌流10min，反复3次，之后行8min全脑缺血，根据LIP与全脑缺血间隔时间不同分为LIP0h、LIP1h、LIP3h、LIP6h、LIP12h、LIP1d和LIP2d组；④LIP的sham+全脑缺血组（n=5）：根据③中结果选择脑保护效果最好的时间点，即暴露双侧股动脉后即刻（LIP0h组）行8min全脑缺血。以上各组大鼠在sham手术或末次缺血再灌后7d断头取脑，冠状切片后分别进行硫堇染色和HE染色。低倍镜下观察硫堇染色的海马组织形态，参照Kitagawa（1990）和Kato（1991）分级方法，对海马CA1区确定组织学分级（histological 为什么 grade，HG），标准如下：0级：无神经元死亡；Ⅰ：散在神经元死亡；Ⅱ级：成片神经元死亡；Ⅲ级：几乎全部神经元死亡。高倍镜计数双侧海马CA1区每1mm区段内细胞膜完整、胞核饱满、核仁清晰的锥体细胞数目，每张切片双侧海马各计数3个区段，取平均数作为神经元密度（neuronal density，ND）。HE染色观察胶质细胞的变化。 硫堇染色结果显示，全脑缺血的sham组大鼠海马CA1区锥体细胞排列整齐、致密，为2～3层，无细胞缺失，细胞形态完整、边界清晰，胞核饱满、核仁深染、清晰，无明显的延迟性神经元死亡（delayedneuronal death, DND），HG为0级，ND值为167±5.21（cells/mm，下同）。全脑缺血组与LIP的sham+全脑缺血组大鼠海马CA1区有明显的组织学损伤，出现严重的DND，锥体细胞形态改变明显，几乎全部神经元死亡或缺失，HG均为Ⅲ级，ND值分别为36±9.28、35±5.

1μM以下。 3)以新引入的结构交叉改变Block B和Block D单元，得到的目标产物以97的活性最好，c-Met IC50为8.6nM，并且97对Met介导的细胞增殖具有明显的抑制作用(90.5%/1μM)。 4)继续以97为改造基础设计了α-烷基取代的哌啶酮类化合物。同时通过骨架迁越设计合成了异黄酮类化合物。该类化合物的生物活性评价正在进行中。

通过上述的活性评价对该类化合物进行了初步的构效关系评价：对Block A苯环的取代对活性的影响较弱；Block B片段以吡啶酮和α-氯代哌啶酮结构最优，环状连接臂结构均优于柔性直链结构片段；Block B与Block C之间连接的酰胺氢是活性必需的；Block D片段以喹啉基取代最优，要强于3-氯-2-氨基吡啶取代。 2、Combretastatin A-4类似物的设计、合成与生物活性研究 本部分在设计合成了CombretastatinA-4(CA-4)的11个类似物，分别以N-甲基化的酰胺键、马来酰胺环和2H-1,4-二硫嗪为连接臂。对所合成的CA-4类似物选用胰腺癌细胞株(BxPC3)、乳腺癌细胞株(MCF-7)、肺癌细胞株(A549)和结肠癌细胞株(HCT116)进行了细胞毒活性评价，发现活性较CA-4的活性下降明显，只有化合物226的细胞毒性保持在纳摩尔级别，但是相比CA-4活性降低了50倍以上。
1目的 肺癌是最常见的肺原发性恶性肿瘤,近年来肺癌的发病率和病死率均迅速上升,其中男性患者中肺癌的死亡率已居首位。其中非小细胞肺癌的发病率在所有肺癌中比例最高。肺癌的发生及发展与肿瘤相关基因的异常表达存在着密切的关系。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian 通常 Everolimus分子量 target of rapamycin,mTOR)作为一种高度保守的蛋白激酶,可以通过整合生长因子和营养信号来调节肿瘤细胞生长,是肿瘤生物调节中的关键性基因。目前mTOR已成为肿瘤治疗的生物靶点。

慢病毒介导的RNA干扰是目前公认的最有效的基因沉默手段之一。本文拟通过利用慢病毒介导的RNA干扰技术,以非小细胞肺癌细胞A549为研究对象,以mTOR为目的靶基因。利用MTT、流式细胞术、克隆形成、Transwell及裸鼠体内试验等技术,分别在体外及体内环境中探讨降低mTOR的表达对A549细胞生物学行为的影响。此外通过检测P70S6K, MT1-MMP, HIF-1a, VEGFA, cyclinD1等基因的表达变化,进一步分析mTOR调控肿瘤生物学功能的分子机制。本研究旨在通过以上实验探讨mTOR在肺癌细胞中的作用及其机理,同时为mTOR作为治疗性靶基因在临床方面的应用、为肺癌的基因治疗、基因药物的研制提供必要的实验依据。

2方法 2.1根据mTOR编码区基因序列,设计合成4条shRNA,并克隆到慢病毒表达载体。转染A549细胞后,应用RT-PCR及western blot检测其干扰效果,并确定干扰效率最好的一条shRNA。最后分别将其包装成带有GFP标签及Puro抗性基因的慢病毒颗粒。 2.2体外实验中,将带有GFP绿色荧光标签的慢病毒感染A549细胞。应用MTT、细胞生长曲线、克隆形成、流式细胞术检测A549细胞的增殖和凋亡能力；应用transwell检测细胞侵袭能力；利用western selleck blot检测mTOR的表达降低对P70S6K,MT1-MMP, HIF-1a, VEGFA, cyclinD1蛋白表达的影响。 2.3体内实验中,利用带有Puro抗性基因的慢病毒感染A549细胞并获得持续表达mTOR shRNA及对照病毒的稳定细胞株。将获得的稳定细胞株扩增并以107/只的细胞浓度接种裸鼠。接种后对裸鼠的体重及肿瘤形成进行监测,分析mTOR的低表达对A549细胞成瘤性的影响。 2.4统计学处理：应用SPSS16.0统计分析软件进行统计学处理,计量资料采用均数士标准差(X±s)表示,多样本均数比较采用方差分析,两两比较采用LSD比较,率的比较采用X2检验等进行统计学处理,显著性检验水准取a=0.05。 3结果3.1成功将四条mTOR shRNA克隆至pSIHl-H1-copGFP慢病毒克隆载体,分别为Sh-mTOR-6506, Sh-mTOR-3266, Sh-mTOR-4995, Sh-mTOR-6216。分别转染A549细胞后,通过RT-PCR及western blot验证mTOR的表达水平后发现,Sh-mTOR-6216对A549细胞中mTOR的抑制率可达70%以上,干扰效率明显高于其他干扰组及对照载体组。然后成功包装含有该shRNA序列的带有GFP荧光标记的慢病毒lenti-GFP-mTOR及Puro抗性基因的慢病毒lenti-Puro-mTOR,分别用于以下的体外实验及体内试验。 3.2体外实验中,利用lenti-GFP-mTOR慢病毒感染A549细胞。感染后48h,MTT检测结果显示：空细胞组,对照慢病毒组及lenti-GFP-mTOR组在570nm的吸光度值分别为：0.687±0.103,0.667±0.037,0.356±0.

05)。2、电镜下观察胆管超微结构显示：SiRNA组胆管细胞出现明显的线粒体肿胀、表面绒毛脱落及嵴断裂等损害,而HO.1组较其它三组则未见明显损害,14d各组差异不明显。3、HO-1组胆管周围无明显炎性细胞浸润,NS组与Ad组可见少量炎性细胞浸润,两组之间无明显差异,SiRNA组胆管周围可见大量炎性细胞浸润,通过免疫组化进一步显示,其中CD3+Kuffer细胞、CD3+、CD45R+T细胞表达HO-1组明显少于其它各组,而在SiRNA组表达最为明显,14d时相各组无明显差异。4、检测1h时相各组胆汁中胆盐的浓度显示,HO-1组胆盐浓度较对照组及SiRNA组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),胆管损伤程度也相应较轻,而SiRNA组胆盐浓度最高,差异均有统计学意义(P0.05)。 结论： 1、通过腺病毒基因转染,诱导大鼠HO-1高表达,可以降低胆管细胞的热缺血再灌注损伤,而抑制HO-1表达,则损伤明显加重。 Temozolomide供应商 2、HO-1可减少胆管周围炎性细胞浸润,可能是通过抑制Kuffer细胞、T淋巴细胞的激活起到细胞保护的作用；

3、HO-1可降低大鼠胆汁中胆盐浓度,从而减轻毒性胆汁对胆管内皮细胞的损伤作用。
目的：癫痫是一种由多种原因引起的，以大脑神经元反复过度同步放电为特征的神经系统慢性疾病。也是育龄妇女常见的神经系统疾病。而癫痫妇女被认为具有较高的妊娠风险。应用抗癫痫药物的癫痫妇女所生婴儿的畸形率是正常孕妇的2到3倍。这些胎儿发生畸形，除了可能与胎儿父母本身的遗传基因有关，也可能与抗癫痫药物的使用有关。此外，癫痫孕妇在孕产期的癫痫强直－阵挛发作，可能造成胎儿宫内缺氧、孕产妇的外伤等对胎儿的发育也会造成不良影响。随着现代社会的发展和科技的进步，人们对健康的要求越来越高，新生儿的健康不仅仅需要出生时无病、无畸形，同样需要出生后的发育正常、心理及行为正常等。癫痫作为妊娠期对孕妇的一种有害刺激，有可能造成子代的发育缺陷。p38是丝裂原激活的蛋白激酶（Mitogen-activated

protein kinase）的一种。它在细胞培养中已被证实对广泛的刺激均有应答，并可诱发多种生物效应，被认为是一个在胚胎发育中重要的调节因子。本实验以戊四氮（pentylenetetrazole，PTZ）诱导SD大鼠慢性癫痫模型，使点燃成功的雌性大鼠怀孕，通过测量仔鼠生长发育指标及观察子鼠海马组织中p38的表达水平来探讨慢性癫痫对孕鼠子代的影响。 Cyclopamine研究购买 方法：通过每天给予腹腔注射PTZ(35mg/kg)建立慢性点燃癫痫模型。将雌性SD大鼠36只（7-8周，起始体重200±20g）随机分为正常对照组（NC组）、盐水假手术组（NS组）和癫痫组（PTZ组）。每组各12只。从第一天开始实验起，每天上午9:00给予PTZ组大鼠腹腔注射1%PTZ35mg/kg，NS组同时给予相应剂量的生理盐水腹腔注射，NC组不做任何处理，每次注射后观察1小时。按照Racine分级标准，连续3次获得Ⅳ级或Ⅳ级以上的运动性惊厥的大鼠可视为完全点燃。待癫痫组大鼠点燃成功后各组继续给药1周，使其与雄性SD大鼠合笼，第二天观察阴栓，有阴栓者记孕0天。各组雌性大鼠怀孕后继续孕前处理至孕20天，在三组孕鼠中每组随机取6只腹腔注射水合氯醛孕鼠后剖腹取出胎鼠，使用Western Blot方法测定胎鼠海马组织中p38及P-p38蛋白表达变化。其余使其自然生产，观察仔鼠中的总胎数、活胎数，死胎数，测量出生时活胎身长，称量仔鼠出生时及第2、4、7、14日体重，观察仔鼠开耳、出牙、睁眼时间，观察仔鼠第2-6天翻正反射所用时间，第3-7天的抓握反应。实验中及时补充因癫痫发作死亡的大鼠，点燃失败的大鼠淘汰出组。

已经 结果： 1生长发育指标观察结果 仔鼠总产数、活胎数、死胎数，NC组、NS组、PTZ组相比较无显著性差异（P>0.05）。仔鼠出生时体长NC组、NS组、PTZ组相比较无显著性差异（P>0.05）。仔鼠出生时体重、出生后第2、4、7、14天体重NC组、NS组、PTZ组相比较无显著性差异（P>0.05）。仔鼠耳廓分离时间NC组、NS组、PTZ组相比较无显著性差异（P>0.05）。仔鼠上齿萌出时间NC组、NS组、PTZ组相比较无显著性差异（P>0.05）。仔鼠睁眼时间NC组、NS组、PTZ组相比较无显著性差异（P>0.05）。仔鼠出生后第2、3、4、5天平面翻正反射所需时间NC组、NS组、PTZ组相比较均有有显著性差异（P0.05）。出生后第6天平面翻正反射所需时间NC组、NS组、PTZ组相比较无显著性差异（P>0.05）。出生后第3-5天的抓握反应PTZ组与NC组、NS组相比较有显著性差异（P0.05）。 2Western-blot:结果 p38在三组海马中的表达分别为NC组（0.660±0.621）、NS组（0.635±0.140）、PTZ组（0.678±0.161），无显著性差异（P>0.05）。 P-p38在三组海马中的表达分别为NC组（0.581±0.098）、NS组（0.649±0.148）、PTZ组（0.969±0.182），与NC组相比较，PTZ组表达水平升高，有显著性差异（P<0.05），与NS组相比较PTZ组表达水平亦升高，有显著性差异（P0.