05）。加入茶多酚干预后，LOX-1mRNA表达均下降，但正常对照组加茶多酚与干预前差异无统计学意义，高糖组加入茶多酚后，差异有统计学意义（P＜0.05）。 4与正常对照组相比，高糖组p38MAPK蛋白浓度增加，差异有统计学意义，加入茶多酚后，其表达量下降，差异有统计学意义。分别与正常对照组及高糖组相比较，加入p38MAPK抑制剂SB203580后，sFlt-1mRNA、蛋白及LOX-1mRNA几乎无表达。 结论： 1高糖环境可以引起脐静脉内皮细胞sFlt-1的表达活性降低，LOX-1含量增加，两者可能在糖尿病血管病变的进程中发挥重要作用。 2茶多酚可以明显降低高糖诱导的脐静脉内皮细胞LOX-1的高表达并上调sFlt-1的表达，减轻高糖对脐静脉内皮细胞的损伤作用，减少动脉硬化的发生及新生血管的形成。 3p38MAPK在高糖环境下可被激活，其抑制剂可明显抑制LOX-1及sFlt-1的表达量，表明高糖诱导的HUVEC的LOX-1及sFlt-1的表达变化可能通过p38MAPK通路。
目的：目前，缺血性脑病的发病率在全球不断上升，形势也日益严峻。多年来，许多研究人员致力于研究脑缺血耐受机体的内源性保护机制，以期提高神经细胞对缺血性损害的抵抗力，使其在遭受较严重的缺血打击后仍保持存活，并在恢复供血后仍具有正常的生理功能。

我室既往研究证实，反复3次股动脉夹闭和再灌的肢体缺血预处理（limb ischemic preconditioning，LIP）可减轻随后即刻发生的脑缺血再灌注引起的大鼠海马CA1区锥体神经元延迟性死亡和凋亡、诱导脑缺血耐受，证实了远隔器官缺血预处理对脑的保护作用。虽然脑缺血的发生无法预测，但是在心肺分流术等一些发生脑缺血危险几率较高的手术中，全脑缺血性损伤是可以预知的。如果能在损伤发生之前就施予干预措施，无疑具有重要的现实意义。因此，探讨LIP脑保护作用的机制可为开发神经保护药物或方法提供新的思路。 MAPK是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在哺乳类细胞目前已发现存在着下述三条并行的MAPKs信号通路：ERK、JNK和p38MAPK通路。我室既往采用免疫组织化学、硫堇染色以及Western

Depsipeptide Z-VAD-FMK 花费 blot等方法研究证实，p38MAPK参与了LIP诱导的大鼠脑缺血耐受，并且在这一过程中上调了HSP70的表达、抑制了凋亡通路、改变了超氧化物歧化酶的活性。但是，p38MAPK的神经保护机制尚不完全清楚。 谷氨酸是中枢神经系统最主要的兴奋性神经递质，但过高浓度的谷氨酸又具有极强的神经毒性。脑缺血时，细胞外液中谷氨酸等兴奋性氨基酸浓度异常升高，通过钙超载、干扰能量代谢等导致细胞损伤。细胞外谷氨酸清除的主要途径是兴奋性氨基酸转运体（excitatory amino transporters,EAATs）摄取谷氨酸。目前已发现五种高亲和力谷氨酸转运体：GLAST（EAAT1）、GLT-1（EAAT2）、EAAC1（EAAT3）、EAAT4和EAAT5。研究证实，GLT-1在防止其兴奋性毒性作用方面发挥着更为重要的作用。因此，对GLT-1进行调制，增强其对细胞外液中谷氨酸的摄取以及防止其出现逆向转运，是防止脑缺血时细胞外液中谷氨酸浓度异常升高及其神经毒性作用的有效方法。我室研究发现，脑缺血预处理可抑制全脑缺血打击引起的海马CA1区锥体神经元的延迟性死亡，同时可上调海马CA1区GLT-1的表达，抑制脑缺血引起的细胞外液中谷氨酸浓度的升高；而应用GLT-1特异性抑制剂DHK或GLT-1反义寡聚脱氧核苷酸后，均能剂量依赖性的阻断脑缺血预处理对全脑缺血大鼠的神经保护作用，提示GLT-1参与了脑缺血预处理诱导的脑缺血耐受。 那么，LIP诱导的脑缺血耐受是否有GLT-1的参与呢？如果有，GLT-1与我们先前研究的p38MAPK之间是否有级联关系？实际上，既往文献中有关p38MAPK对GLT-1调制作用的研究已有报道。2009年，Tsai等在百日咳毒素致热痛觉过敏大鼠模型中发现，p38MAPK特异性抑制剂SB203580能减轻此种痛敏反应、增加脑脊液中兴奋性氨基酸、下调谷氨酸转运体的表达。此外，Matos等在阿耳茨海默氏病的研究中证实，SB203580能够下调星形胶质细胞中GLT-1的表达。我室在近期的工作中，也证实了p38MAPK通过调制GLT-1在脑缺血预处理诱导的脑缺血耐受中发挥了重要作用。 因此，本研究的目的在于：①观察LIP不同时间窗对脑缺血再灌注损伤的影响，并应用GLT-1特异性抑制剂DHK，观察抑制GLT-1表达对LIP诱导的脑缺血耐受的影响；②观察并比较LIP后大鼠海马CA1区p38MAPK和GLT-1表达的时间过程；③应用p38MAPK抑制剂SB203580，观察抑制p38MAPK后，大鼠海马CA1区GLT-1表达的变化。通过上述研究，探讨p38MAPK是否通过调制GLT-1参与肢体缺血预处理诱导的脑缺血耐受，为脑缺血性疾病的防治提供新的思路。

1LIP减轻大鼠全脑缺血再灌注引起的海马CA1区迟发性神经元死亡及GLT-1在此过程中的作用 1.1观察LIP不同时间窗对脑缺血再灌注损伤的影响 50只Wistar大鼠永久凝闭双侧椎动脉恢复两天后，随机分为四组：①全脑缺血的sham组（n=5）：暴露双侧颈总动脉8min，但不阻断血流；②全脑缺血组（n=5）：夹闭双侧颈总动脉8min后恢复再灌注；③LIP+全脑缺血组（n=35）：夹闭双侧股动脉10min、再灌流10min，反复3次，之后行8min全脑缺血，根据LIP与全脑缺血间隔时间不同分为LIP0h、LIP1h、LIP3h、LIP6h、LIP12h、LIP1d和LIP2d组；④LIP的sham+全脑缺血组（n=5）：根据③中结果选择脑保护效果最好的时间点，即暴露双侧股动脉后即刻（LIP0h组）行8min全脑缺血。以上各组大鼠在sham手术或末次缺血再灌后7d断头取脑，冠状切片后分别进行硫堇染色和HE染色。低倍镜下观察硫堇染色的海马组织形态，参照Kitagawa（1990）和Kato（1991）分级方法，对海马CA1区确定组织学分级（histological 为什么 grade，HG），标准如下：0级：无神经元死亡；Ⅰ：散在神经元死亡；Ⅱ级：成片神经元死亡；Ⅲ级：几乎全部神经元死亡。高倍镜计数双侧海马CA1区每1mm区段内细胞膜完整、胞核饱满、核仁清晰的锥体细胞数目，每张切片双侧海马各计数3个区段，取平均数作为神经元密度（neuronal density，ND）。HE染色观察胶质细胞的变化。 硫堇染色结果显示，全脑缺血的sham组大鼠海马CA1区锥体细胞排列整齐、致密，为2～3层，无细胞缺失，细胞形态完整、边界清晰，胞核饱满、核仁深染、清晰，无明显的延迟性神经元死亡（delayedneuronal death, DND），HG为0级，ND值为167±5.21（cells/mm，下同）。全脑缺血组与LIP的sham+全脑缺血组大鼠海马CA1区有明显的组织学损伤，出现严重的DND，锥体细胞形态改变明显，几乎全部神经元死亡或缺失，HG均为Ⅲ级，ND值分别为36±9.28、35±5.