质粒鉴定结果显示在100bp左右扩增出一明亮条带,与理论碱基对吻合,质粒鉴定正确。免疫细胞化学鉴定提示KIM-1表达定位于细胞膜,PCR及Western-Blot提示转染的HK2细胞高表达KIM-1。 2. pcDNA-hKIM-1-HK2细胞具有明显的抗缺氧损伤作用,细胞增殖活力高于对照组,细胞凋亡数量及流式细胞仪检测的缺氧早、中、晚期凋亡指数明显低于对照组(p
第一部分fractalkine对BV-2小胶质细胞胞内钙离子浓度及其胞内效应的影响 目的探讨fractalkine诱导BV-2小胶质细胞胞内钙离子浓度变化的机制及其产生的胞内效应。方法不同浓度fractalkine刺激BV-2小胶质细胞,激光共聚焦显微镜测定[Ca~(2+)]i的变化;10nM

fractalkine孵育BV-2小胶质细胞0、30、60、120、240min,westernblot测定p38MAPK、p-p38MAPK的表达;10nM fractalkine孵育BV-2小胶质细胞0、6、12、24h,RT-PCR及Elisa检测白介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)基因水平及蛋白水平的表达。预先60s给予fractalkine的受体的拮抗剂anti-CX3CR1和IP_3R的拮抗剂2-APB再给予fractalkine,激光共聚焦显微镜测定[Ca~(2+)]i的变化;Westernblot测定p38MAPK、p-p38MAPK的表达;预先60s给予fractalkine的受体的拮抗剂anti-CX3CR1、IP_3R的拮抗剂2-APB和p38MAPK的抑制剂再给予fractalkine,Elisa检测白介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达。结果fractalkine引起BV-2细胞[Ca~(2+)]i增加,p-p38MAPK及其IL-1β、TNF-α表达增加(P<0.05)。结论fractalkine可以通过促发小胶质细胞IP_3钙信号,激活p38MAPK,引起IL-1β和TNF-α蛋白表达,导致热痛觉过敏。
研究背景和目的: SKI-606分子量 骨是由细胞、细胞外基质和无机物组成的特殊结缔组织,是人体承担力学载荷的主要器官,并通过骨组织细胞进行骨塑建和重建。骨重建不仅受到遗传、激素、新陈代谢、年龄等生物学因素的影响,而且还依赖于其所处的力学环境。由Wolff定律可知,力学载荷缺失导致骨量减少,而适度的力学刺激能够促进骨形成。成骨细胞来源于间充质干细胞,是骨生长、重建和修复的关键细胞。成骨细胞以及它的前体细胞对周围生物力学环境的变化非常敏感,可以将感受到的力学信号转变为生物学信号进而调节骨内环境稳定。体内骨组织所处的力学环境非常复杂,附着于骨基质上的成骨细胞会受到多种生物学因素的干扰,因此,体内实验很难准确反映力学刺激对成骨细胞的影响。对体外培养的成骨细胞进行离体力学加载实验可以有效排除体内实验中各种因素的干扰。此外,还可以设计力的加载方式、大小、频率以及作用时间等力学参数准确检测力学刺激对成骨细胞的影响。成骨细胞是骨对力学信号进行响应的效应细胞,但力学刺激对成骨细胞的影响以及成骨细胞的力学信号响应机制仍不明确。本研究拟通过四点弯曲力学加载装置对培养的成骨细胞系MC3T3-E1细胞进行不同强度和不同时间的力学拉伸,研究力学信号对成骨细胞增殖、凋亡、分化和矿化的影响,并深入探讨成骨细胞的力学信号响应机制,为进一步研究力学条件下骨发生、重建的生物学机制提供理论依据。

所以 研究方法: 1.应用四点弯曲力学加载装置对小鼠成骨细胞系MC3T3-E1细胞施加频率为0.5 HZ,不同强度(500με、1000με、2000με、3000με、5000με)的力学拉伸应变,力学拉伸结束后采用MTT实验检测细胞增殖情况、DNA ladder和流式细胞术检测细胞凋亡情况、RT-PCR和Western S3I-201半抑制浓度 Blot检测细胞分化标志基因表达情况、Von Kossa染色检测细胞矿化情况。 2.给MC3T3-E1细胞施加强度为2000με,频率为0.5 HZ不同时间(2h、4h、8h、12h、24h)的力学拉伸应变,拉伸结束后对成骨细胞的增殖、凋亡、分化和矿化情况进行检测。 3.采用RT-PCR和Western Blot方法检测力学拉伸应变对BMPs/Smad信号通路中各个分子表达的影响;采用ELISA方法检测力学拉伸后成骨细胞培养基中BMP-2和BMP-4的含量;采用Western Blot方法检测力学拉伸应变对Smad蛋白的活化以及p-Smad向细胞核转移的影响。 4.力学拉伸前2h以Noggin预处理MC3T3-E1细胞,然后进行8h的力学拉伸,检测阻断BMPs通路对力学拉伸过程中Smad蛋白的活化以及成骨细胞分化标志基因表达的影响;力学拉伸前转染Smad4 siRNA抑制Smad4的表达,然后进行8h的力学拉伸,检测力学拉伸后p-Smad的细胞核转移情况以及成 骨细胞分化标志基因的表达情况。5.采用Western Blot方法检测力学拉伸后p38MAPK和NF-κB通路的活化情况;力学拉伸前以PDTC预处理MC3T3-E1细胞,检测阻断NF-κB通路对力学拉伸过程中BMPs表达的影响;力学拉伸前以Noggin预处理MC3T3-E1细胞,检测力学拉伸过程中p38MAPK的激活与BMPs信号的关系;力学拉伸前以SB203580预处理MC3T3-E1细胞,检测阻断p38MAPK通路对力学拉伸过程中NF-κB通路的激活、BMPs的表达以及成骨细胞分化标志基因表达的影响。

6.采用RT-PCR和Western Blot方法检测力学拉伸应变对Smurf1、Smurf2和CKIP-1表达的影响。 7.力学拉伸前转染Smurf1 siRNA,然后进行8h的力学拉伸,检测抑制Smurf1的表达对力学拉伸过程中Smad、p-Smad以及成骨细胞分化相关基因表达的影响;力学拉伸前以MG132预处理MC3T3-E1细胞,检测抑制蛋白酶体活性对力学拉伸过程中Smad和p-Smad的含量以及成骨细胞分化相关基因表达的影响。 实验结果: 1. 1000με、2000με和3000με的力学拉伸强度能促进成骨细胞分化标志基因的表达,其中2000με的作用最明显,但各个力学拉伸强度均未影响成骨细胞的增殖、凋亡和矿化。 2. 2000με应变强度下,不同时间的力学拉伸对成骨细胞增殖、凋亡和矿化没有明显作用。力学拉伸过程中成骨细胞分化标志基因表达的上调有一定的时间依赖性:ALP的表达在力学拉伸4h时开始显著升高,8h时表达最强,24h后恢复正常水平;OCN的表达在力学拉伸8h时开始显著升高,并持续高表达至24h;而Col I的表达在力学拉伸4h时开始显著上调,24h时表达水平仍高于对照组。 3.力学拉伸应变能够促进BMP-2和BMP-4的表达和分泌。BMPRⅠ、Smad1和Smad5 mRNA表达水平没有明显变化,但它们的蛋白水平在力学拉伸后升高。Smad1和Smad5在力学拉伸过程中被激活,且激活的Smad(p-Smad)在细胞核内的含量升高。 4.