明确RSG对颅骨成骨细胞分化的影响极其机制。2.明确明确RSG对颅骨成骨细胞增殖的影响及其机制； 本论文的第二个部分在成骨样细胞MG-63上进行。雌激素对于绝经后骨质疏松的治疗，效果显著。但同时又存在易诱发乳腺癌、子宫内膜癌等潜在危险因素。近年来，植物雌激素作为一种天然的选择性雌激素受体调节剂（SERM），在骨质疏松的防治中日益受到关注。大豆异黄酮是其中最具代表性的一类。大豆异黄酮(soybeanisoflavone)，属植物黄酮类，主要来源于豆科蝶形花亚科植物，是一类具有广泛营养学价值，健康保护和治疗学意义的非固醇类物质。大豆异黄酮的结构与雌激素相似，能够与雌激素受体(ERs)结合，进而发挥转录调节的作用。ER分为α和β两种亚型，雌激素与ER结合后，除了通过经典的ERE途径调节基因转录外；也有大量的文献报道，雌激素还可以通过蛋白-蛋白间的相互作用，调节CRE介导的基因转录。异黄酮类植物雌激素是否也能像雌激素一样，对ERE和CRE介导的基因转录都具有调节作用呢？有关这方面的报道，结论不一。因此，我们在MG63细胞上，主要进行了两方面的研究：1.比较大豆异黄酮与雌激素在雌激素经典作用途径中的作用异同，即两者对ERE报告基因的转录调节作用有何差别；2.比较大豆异黄酮与雌激素在雌激素非经典作用途径中的作用异同，即两者对CRE报告基因的转录调节作用有何差别。

无 主要实验结果如下： 一、罗格列酮对颅骨成骨细胞增殖及分化的调节作用 （一） RSG抑制颅骨成骨细胞分化的作用及其机制 1、在原代培养的小鼠颅骨细胞上，利用β-磷酸甘油和L-抗坏血酸共同诱导其成骨细胞的成熟，给予不同浓度的RSG（10-9～10-6M）连续处理10天。RSG能剂量依赖性的抑制碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、1型胶原蛋白（type1collagen，Col1）、Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor2，Runx2）、骨钙素（osteocalcin，OC）等成骨相关基因的mRNA表达。 2、在诱导条件培养基培养，并给予不同浓度的RSG（10-9～10-6M）连续处理21天，利用茜素红染色以及碱性磷酸酶活性检测，观察RSG对骨钙结节形成的影响。结果显示，RSG能显著抑制钙结节的形成，抑制碱性磷酸酶的活性，其抑制效应呈现剂量依赖性。

3、 Wnt/β-catenin通路已知在促进成骨细胞分化成熟过程中发挥主要作用。作为调节Wnt信号通道中最关键的事件之一，β-catenin在胞内的水平可受到GSK-3β的调节。当GSK3β被激活能促进β-catenin的降解，降低其在胞内的表达水平，从而抑制骨形成。为明确RSG抑制成骨细胞的分化是否是通过激活GSK3β实现的。我们选取GSK3β的特异性阻断剂SB216763（2*10-5M）与RSG（10-6M）共同处理成骨细胞。SB216763能完全逆转RSG抑制Col1，ALP，Runx2，OC等成骨相关基因的mRNA表达。 4、用SB216763（2*10-5M）与RSG（10-6M）共同处理成骨细胞21天，SB216763能完全逆转RSG对制钙结节形成以及碱性磷酸酶活性的抑制作用。以上结果提示，RSG抑制成骨细胞的分化是通过激活GSK3β实现的。

5、为进一步探讨RSG作用的受体机制，我们联合使用PPARγ特异性阻断剂GW9662（10-6M）与RSG（10-6M），分别观察成骨相关基因，骨钙形成以及碱性磷酸酶活性的变化，以明确RSG抑制成骨细胞的分化是否通过PPARγ。结果显示，GW9662只能部分逆转RSG对上述观察项目的抑制效应。进一步利用siRNA干扰技术，敲低细胞内的PPARγ，所得结果与使用GW9662的作用一致。以上结果提示RSG激活GSK3β的作用仅部分通过PPARγ实现。 所以 6、有文献报道，RSG在骨细胞上可以不依赖于PPARγ，而是通过膜受体GPR40发挥作用。为明确在成骨细胞上，RSG是否也存在同样的作用机制，我们使用GPR40的激动剂GW9508（10-5M）单独处理细胞，未观察到其对成骨基因mRNA表达的影响。接着，又利用siRNA技术敲低细胞内的GPR40，再用RSG（10-6M）处理，分别观察成骨基因的表达，骨钙形成以及碱性磷酸酶活性等指标。结果显示，敲低GPR40后，也只能部分逆转RSG对上述指标的抑制作用。同时，我们还观察了RSG对PPARγ以及GPR40蛋白表达的影响。结果显示，在不给诱导条件时，细胞内PPARγ处于极低的水平，而GPR40水平较高。给予诱导条件后，PPARγ表达增多，而GPR40的表达显著降低。在RSG处理后，PPARγ和GPR40都剂量依赖的表达增多。提示GPR40在成骨诱导过程中维持低表达，RSG可促进GPR40表达，后者由此介导了部分RSG作用。 Regorafenib体外 7、我们还观察了诱导成骨细胞成熟过程中，SHP-1的mRNA和蛋白表达的变化。发现随诱导时程的延长，SHP-1mRNA和蛋白表达呈现时间依赖性增加。给予不同浓度的SHP-1的特异性拮抗剂NSC87877处理。NSC87877对上述成骨基因mRNA的表达以及β-catenin的蛋白表达均有显著的抑制作用，并呈剂量依赖性。进一步，利用siRNA技术敲低细胞内的SHP-1或是过表达无催化活性的SHP-1突变质粒，均能显著抑制成骨基因的表达。提示SHP-1具有促进成骨细胞成熟的作用。 8、给予GSK3β特异性阻断剂SB216763与NSC87877共同作用，SB216763能逆转NSC87877抑制β-catenin蛋白表达的作用，提示，SHP-1促进成骨的作用是通过抑制GSK3β的激活实现的。 9、给予RSG处理，成骨细胞中SHP-1的mRNA表达显著下降，提示RSG抑制成骨细胞中SHP-1的mRNA表达。 （二） RSG抑制颅骨成骨细胞增殖的作用及其机制 1.